[发明专利]诱骗受体3的基因构建表达纯化和特异性鉴定方法

摘要

诱骗受体3基因构建表达纯化和特异性鉴定方法，涉及一种基因，提供诱骗受体3基因的构建、表达、纯化和特异性鉴定方法。诱骗受体3基因的构建方法为设计引物：从GenBank(AY358279查得DcR3 cDNA全序列，获取编码DcR3的原始基因序列；去除N端29个信号肽序列，根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列前提下，将DcR3的核苷酸序列修改后的DcR3序列分成12个长引物片段，命名为F1，R2，F3，R4，F5，R6，F7，R8，F9，R10，F11，R12，利用引物F1和R12引入Nco I和XhoI酶切位点；通过PCR反应获取DcR3基因。

主权项

1、诱骗受体3的基因构建方法，其特征在于其步骤为：1)设计引物：从GenBank(AY358279)上查得DcR3cDNA全序列，获取编码DcR3的原始基因序列ATGAGGGCGCTGGAGGGGCCAGGCCTGTCGCTGCTGTGCCTGGTGTTGGCGCTGCCTGCCCTGCTGCCGGTGCCGGCT GTACGCGGAGTGGCAGAAACACCCACCTACCCCTGGCGGGACGCAGAGACAGGGGAGCGGCTGGTGTGCGCCCAGTGCCCCCCAGGCACCTTTGTGCAGCGGCCGTGCCGCCGAGACAGCCCCACGACGTGTGGCCCGTGTCCACCGCGCCACTACACGCAGTTCTGGAACTACCTGGAGCGCTGCCGCTACTGCAACGTCCTCTGCGGGGAGCGTGAGGAGGAGGCACGGGCTTGCCACGCCACCCACAACCGTGCCTGCCGCTGCCGCACCGGCTTCTTCGCGCACGCTGGTTTCTGCTTGGAGCACGCATCGTGTCCACCTGGTGCCGGCGTGATTGCCCCGGGCACCCCCAGCCAGAACACGCAGTGCCAGCCGTGCCCCCCAGGCACCTTCTCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCCCACCGCAACTGCACGGCCCTGGGCCTGGCCCTCAATGTGCCAGGCTCTTCCTCCCATGACACCCTGTGCACCAGCTGCACTGGCTTCCCCCTCAGCACCAGGGTACCAGGAGCTGAGGAGTGTGAGCGTGCCGTCATCGACTTTGTGGCTTTCCAGGACATCTCCATCAAGAGGCTGCAGCGGCTGCTGCAGGCCCTCGAGGCCCCGGAGGGCTGGGGTCCGACACCAAGGGCGGGCCGCGCGGCCTTGCAGCTGAAGCTGCGTCGGCGGCTCACGGAGCTCCTGGGGGCGCAGGACGGGGCGCTGCTGGTGCGGCTGCTGCAGGCGCTGCGCGTGGCCAGGATGCCCGGGCTGGAGCGGAGCGTCCGTGAGCGCTTCCTCCCTGTGCACTGA，其中加横线部分代表信号肽；然后去除N端29个信号肽序列，根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，将DcR3的核苷酸序列修改为：TAGGCCATGGATGTGGCAGAAACACCGACCTACCCGTGGCGTGACGCAGAGACAGGGGAACGTCTGGTGTGCGCCCAGTGTCCGCCAGGCACCTTTGTGCAGCGTCCATGCCGCCGTGACAGCCCGACGACGTGCGGCCCATGTCCTCCGCGCCATTACACCCAGTTCTGGAACTACCTGGAGCGCTGTCGCTACTGCAACGTCCTGTGCGGTGAGCGTGAGGAGGAGGCACGTGCTTGCCATGCCACCCATAACCGCGCCTGCCGCTGCCGCACCGGCTTCTTCGCGCATGCTGGTTTCTGCTTGGAGCATGCATCTTGTCCACCGGGTGCCGGCGTGATTGCCCCGGGCACCCCGAGCCAGAACACGCAGTGCCAACCGTGCCCGCCGGGTACCTTCTCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAATGCCAGCCGCATCGCAACTGCACGGCCCTGGGCCTGGCCCTCAATGTGCCGGGCTCTAGTTCCCATGACACCCTGTGCACCAGCTGCACTGGCTTCCCGCTCAGCACCCGTGTACCGGGAGCTGAGGAGTGTGAACGTGCCGTCATCGACTTTGTGGCTTTCCAGGACATCTCCATCAAGCGTCTGCAGCGGCTGTTGCAAGCCTTAGAGGCCCCGGAGGGCTGGGGTCCGACACCGCGTGCGGGCCGCGCGGCCTTGCAGCTGAAGCTGCGTCGTCGTCTCACGGAGCTCCTGGGGGCGCAGGACGGGGCACTGCTGGTGCGTCTGTTACAGGCGCTGCGCGTGGCCCGTATGCCCGGGCTGGAACGTAGCGTTCGTGAGCGCTTCTTACCGGTGCATCTCGAGCTCT，其中加横线部分代表酶切位点；将修改后的DcR3序列分成12个长引物片段，分别命名为F1，R2，F3，R4，F5，R6，F7，R8，F9，R10，F11，R12，每条引物之间有12个碱基互补，利用引物F1和R12引入NcoI和XhoI酶切位点，DcR3引物详见表1： 表1 序号 引物产物(bp) D1 D2 D3 D4 D5 D6 F1 5’GGCCATGGATGTGGCAGAAACACCGACCTACCCGTGGCGTGACG CAGAGACAGGGGAACGTCTGGTGTGCGCCCAGTGTCCGCCAGGC 3’ R2 5’TGGGTGTAATGGCGCGGAGGACATGGGCCGCACGTCGTCGGGC TGTCACGGCGGCATGGACGCTGCACAAAGGTGCCTGGCGGACAC 3’ F3 5’TACACCCAGTTCTGGAACTACCTGGAGCGCTGTCGCTACTGCAA CGTCCTGTGCGGTGAGCGTGAGGAGGAGGCACGTGCTTGCCAT 3’ R4 5’AGATGCATGCTCCAAGCAGAAACCAGCATGCGCGAAGAAGCCG GTGCGGCAGCGGCAGGCGCGGTTATGGGTGGCATGGCAAGCACG3’ F5 5’ATGCATCTTGTCCACCGGGTGCCGGCGTGATTGCCCCGGGCAC CCCGAGCCAGAACACGCAGTGCCAACCGTGCCCGCCGGGTACCT 3’ R6 5’ACATTGAGGGCCAGGCCCAGGGCCGTGCAGTTGCGATGCGGCTG GCATTGCTCTGAGCTGGAGCTGCTGGCTGAGAAGGTACCCGGCG 3’ F7 5’CCTCAATGTGCCGGGCTCTAGTTCCCATGACACCCTGTGCACCAG CTGCACTGGCTTCCCGCTCAGCACCCGTGTACCGGGAGCTGA 3’ R8 5’TTGCAACAGCCGCTGCAGACGCTTGATGGAGATGTCCTGGAAAGC CACAAAGTCGATGACGGCACGTTCACACTCCTCAGCTCCCGGT 3’ F9 5’GCTGTTGCAAGCCTTAGAGGCCCCGGAGGGCTGGGGTCCGACACC GCGTGCGGGCCGCGCGGCCTTGCAGCTGAAGCTGCGTCGTCGG 3’ R10 5’GCATACGGGCCACGCGCAGCGCCTGTAACAGACGCACCAGCAGTG CCCCGTCCTGCGCCCCCAGGAGCTCCGTGAGACGACGACGCAG 3’ F11 5’GCCCGTATGCCCGGGCTGGAACGTAGCGTTCGTGAGCG 3’ R12 5’GAGCTCGAGATGCACCGGTAAGAAGCGCTCACGAACG 3’ 166 166 166 166 166 66在表1中，加粗碱基是改变后的碱基位点；2)获取DcR3基因：(1)第1轮PCR反应：将两条引物F1、R2，F3、R4，F5、R6，F7、R8，F9、R10，F11、R12既作为引物，又作为模板，分别生成产物D1、D2、D3、D4、D5、D6；用灭菌超纯水补齐，进行PCR扩增；(2)第2轮PCR反应：以D1与D2为模板、引物，合成产物D7；以D3与D4为模板、引物，合成产物D8；以D5与D6为模板、引物合成产物D9；(3)第3轮PCR反应：以D8与D9为模板引物，合成产物D11；(4)第4轮PCR反应：以D7与D11为模板、引物，合成产物D12；用灭菌超纯水补齐，进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物经琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果。