[发明专利]高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法。动物免疫、分离脾细胞、细胞融合、筛选杂交肿瘤细胞、单克隆抗体特异性筛选、单克隆抗体纯化保存等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的高效价、高特异性的单克隆抗体在现有技术中尚属空白的问题。可直接应用于临床检测和基础研究，在生物学和医学研究领域中具有极高的应用价值，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。

主权项

1、高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤：(1)动物免疫：将高纯度的人神经巢蛋白1-10ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选：选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选；(6)单克隆抗体纯化保存：选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位为1.44时浓度为1-10mg/ml。