[发明专利]实时荧光定量RT－PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测人前列腺癌微小转移的试剂盒，公开了一种应用实时荧光定量RT－PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒的技术方案，主要涵概下列步骤：红细胞裂解法分离人外周血单个核细胞，Trizol试剂提取单个核细胞总RNA，用M－MLV反转录酶将单个核细胞RNA反转录为cDNA第一链，TaqMan探针法进行荧光实时定量RT－PCR的检测。本发明的有益效果：本方法采用了Taqman探针荧光实时定量RT－PCR技术，大大提高了PSA和PSMAmRNA检测的灵敏度和特异性，有效克服了常规RT－PCR扩增出现假阳性结果的缺点，其灵敏度可以达到检测10⁷个单个核细胞中存在的一个前列腺细胞。本发明建立的检测方法、设计的引物、探针以及对临床样品的检测结果，为荧光实时定量PCR检测试剂盒的开发提供了可靠的依据。

主权项

1.一种实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，包含红细胞裂解液、RNA提取试剂、RT反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应液、Taq酶、标准品和对照品；其特征在于：RNA提取试剂包括RNA萃取试剂、RNA洗涤液、UNIQ-10柱和DEPC-H2O，RT反应液包括DEPC-H2O、M-MLV RT缓冲液、随机引物N6和dNTPs，PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs，检测用上下游引物和荧光探针；检测用上游引物和下游引物：PSA上游引物序列为：5’-CAG TCT GCG GCG GTG TT-3’PSA下游引物序列为：5’-GCA AGA TCA CGC TTT TGT TCC T-3’PSMA上游引物为：5’-AAC TGG ACC CCA GGT CTG GA-3’PSMA下游引物为：5’-GAG GAT TTT ATA AAC CAC CCG AA-3’GAPDH上游引物为：5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’GAPDH下游引物为：5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’荧光探针序列：PSA荧光探针序列为：5’-FAM-CCC CAG TGG GTC CTC ACA GCT GC-TAMRA-3’PSMA荧光探针序列为：5’-FAM-CTG CAG GGC TGA TAA GCG AGG CA-TAMRA-3’GAPDH荧光探针序列为：5’-FAM-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-TAMRA-3’。