[发明专利]一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法。首先是用杂合基因型种子诱导愈伤，剥去谷壳，乙醇和汞浸泡一定时间，用灭菌水清洗后置于诱导培养基上，放置在光照培养室诱导愈伤；其次是抽提愈伤DNA，把诱导的愈伤剥离下来，放在继代培养基上，挑取一粒诱导出的愈伤，利用CTAB法抽提愈伤总DNA，加入水溶解；第三是通过PCR扩增愈伤总DNA，白化苗基因型中a+b不扩增，a+c扩增，用TBE胶电泳PCR产物检测愈伤基因型；第四是挑选出经PCR检测的白化苗纯合基因型愈伤，置于分化培养基上，放置在光照培养室，进行分化验证。用该方法可鉴定由T－DNA插入造成的纯合隐性基因失活而导致的致死、不育、早衰等无法收到种子的突变体的纯合基因型的愈伤，用于功能互补实验。

主权项

1、一种鉴定白化苗基因型愈伤的方法，它包括下列步骤：A、用杂合基因型水稻植株收获的种子诱导愈伤，通过筛选T-DNA的插入的突变体库，得到T-DNA的插入造成基因失活而在T1代产生白化苗突变体家系，利用Tail-PCR分离T-DNA插入位点的水稻DNA序列，在T1代植株中在该T-DNA插入位点将出现三种基因型：两条姐妹染色体全有T-DNA插入的为白化苗纯合基因型、一条染色体上有T-DNA插入的为杂合基因型和该位点染色体上无T-DNA插入的为阴性纯合基因型，在插入位点T-DNA两端的水稻基因组上各设计一条引物a：5’-GCA AAA CAG ACT GCG GTG AG-3’，b：5’-GAG CCG AGTTAA GAC AAC GAT C-3’，引物c：5’-AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA-3’为载体左末端用于测序的引物，抽提苗期DNA进行PCR扩增，白化苗纯合基因型中a+b不扩增，a+c扩增；杂合基因型中a+b、a+c能扩增，该位点无T-DNA插入的阴性纯合基因型中a+b能扩增，a+c不能扩增，种植家系绿苗，检测出杂合基因型植株，收获种子，剥去谷壳，75％的乙醇浸泡1分钟，0.15％的升汞浸泡15分钟，用灭菌水清洗5-6次后置于诱导培养基上，放置在27℃光照培养室50天，诱导愈伤；B、抽提愈伤DNA，把诱导的愈伤剥离下来，放在继代培养基上，挑取一粒诱导出的愈伤，利用CTAB法抽提愈伤总DNA，加入400μl水溶解DNA；C、利用a，b，c引物PCR扩增愈伤DNA，白化苗纯合基因型中a+b不能扩增，a+c扩增，1％的TBE胶电泳PCR产物，检测愈伤基因型；D、挑选出经PCR检测的白化苗纯合基因型愈伤，置于分化培养基上，放置在28℃光照培养室40天，进行分化验证，得到白化苗再生植株。