[发明专利]利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法及应用无效
申请号: | 200610018770.4 | 申请日: | 2006-04-14 |
公开(公告)号: | CN1873010A | 公开(公告)日: | 2006-12-06 |
发明(设计)人: | 严海燕;郭晓芳 | 申请(专利权)人: | 中国科学院武汉植物园 |
主分类号: | C12N15/63 | 分类号: | C12N15/63;C12N15/64;C12N15/29;C07H21/04;C12N1/20;C12N15/82 |
代理公司: | 武汉宇晨专利事务所 | 代理人: | 王敏锋 |
地址: | 43007*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | 本发明公开了一种利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法及应用,其步骤是首先根据GenBank中的Ara h3的基因序列设计两对嵌套引物;其次是以P23和P1483为引物,花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR;第三是将第一轮PCR产物用无离子水稀释作模板,P81和P820为引物进行第二轮PCR;第四是将第二轮PCR的特异带从胶上切下,用回收试剂盒进行回收;第五是表达载体3PG6的构建;同时还涉及转基因载体3PG6在花生中的应用。本发明方法易行,操作方便。 | ||
搜索关键词: | 利用 花生 ara h3 启动子 转基因 载体 制备 方法 应用 | ||
【主权项】:
1、一种利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法,它包括下列步骤:A、根据GenBank中的Ara h3的基因序列设计两对嵌套引物,分别是:P23:CTC TTT CTT TCT TTC TTG CAT TAT A;P1483:GCT GTT GGC TTT GGT CTT CTC CTT;P81:ATA AAC TTG TAT GCC AAA AAA AAC T;P820:CAA TGT AAC CGC CCT CC;B、以P23和P1483为引物,花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR:PCR反应体系:Taq酶缓冲液/含有Mg2+2.5ul,dNTP/10mM each 0.5ul,P23、P1483引物/10uM各1ul,花生基因组DNA/100ng 0.5ul,Taq DNA聚合酶0.5ul,加灭菌双蒸水至25ul;C、将第一轮PCR产物用无离子水稀释10倍作模板,P81和P820为引物进行第二轮PCR:PCR反应体系:Taq酶缓冲液/含有Mg2+2.5ul,dNTP/10mM each0.5ul,P81、P820引物/10uM各1ul,P23和P1483PCR产物稀释10倍后取1ul,Taq DNA聚合酶0.5ul,加灭菌双蒸水至25ul;D、将第二轮PCR的特异带从胶上切下,用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收:首先是将凝胶放在在紫外灯下用刀片将条带切下,装入灭菌的离心管中,称取胶的重量,每个管中胶的重量不能超过400mg;其次是按照400ul/100mg胶的比例加入Binding Buffer,置于50℃的水浴中10min,使胶底融化,50℃加热熔胶时,每2分钟混匀一次;第三是将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2min,8000rpm离心1min;第四是取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管中,加入500ul Washing Solution,8000rpm室温离心1min,然后重复本步骤一次;第五是取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNI1-10柱放入同一个收集管中,12000rpm室温离心15sec;第六是将UNIQ-10柱放入一个1.5ml离心管中,在柱子膜中央加30ul Elution Buffer,室温放置2min;第七是12000rpm室温离心1min,离心管中的液体即为回收的DNA片段,保存于-20℃备用;E、将纯化后PCR特异带与pMDT18T-载体连接:a、回收的DNA片段 5ul;b、pMD18T-载体 0.5ul;c、Ligation Mix 5ul;将上述a、b、c混匀,在16℃连接4h,用于转化大肠杆菌DH5α;F、PCR特异带与pMDT18T-载体连接产物的转化:a、大肠杆菌感受态细胞的制备:首先是从保存有DH5α的LB平板上挑取一个单菌落接种到5ml的LB液体培养基中,于37℃,250r/min震荡培养过夜;其次是次日将此5ml菌液转移到50ml的LB液体培养基中,继续培养至OD600=0.4;第三是将菌液在无菌条件下转移到预先冰冷的10ml离心管中,于冰上放置30min,中间晃动4-6次,使菌液得到预冷;第四是4℃,4000rpm离心10min;第五是倒掉上清液,每管中加入1ml预先冰冷的0.1M CaCl2,拍管壁直至沉淀悬浮,将5管中的细胞集中至1管,加CaCl至10ml,冰上放置;第六是4℃,4000rpm离心10min;第七是弃去上清,加入冰上预冷的1.6ml CaCl2和0.4ml灭菌甘油,拍管壁使沉淀悬浮;第八是分装成100ul/管,-70℃保存备用;b、大肠杆菌感受态细胞的转化:首先是从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上10min;其次是将连接好的产物加至感受态细胞中,混匀,冰上放置30min;第三是42℃热激90sec,在此过程中不要晃动离心管;第四是热激完毕后拿出放于冰上2min;第五是加入200ul的LB液体培养基,37℃,200r/min孵育1h;第六是将菌液涂布在Amp抗性且含有IPTG和X-gal的LB固体平板上,37℃培养12h;第七是将平板放入4℃冰箱保存;G、表达载体3PG6的构建:首先是提取pBIN-35S mGFP质粒和D步骤所构建的3pU6质粒;其次是XbaI和HindIII酶切pBIN-35S mGFP质粒,酶切产物电泳后有一条13kb和一条700-800bp的带,回收其中的13kb的片段;第三是XbaI和HindIII同样酶切3pu6质粒,酶切产物电泳后有一条2kb和一条700-800bp的带,回收其中的700-800bp的片段;第四是将GFP质粒的13kb片段和3pu6质粒的700-800bp片段进行连接,连接体系:35S质粒片段 4ul3pU6质粒片段 4ulT4连接酶Buffer 1ulT4连接酶 1ul22℃反应3h;第五是连接产物转化至DH5α感受态细胞中;第六是提取质粒进行PCR鉴定,有一条700-800bp的亮带,质粒为3pG6。
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