[发明专利]噬菌体免疫PCR检测病原的方法

摘要

本发明公开了一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，其步骤是首先把特异识别病原的单克隆抗体包被于酶标板上捕获样品中的病原抗原，然后加入特异识别病原抗原的重组噬菌体，洗涤后结合到样品上的噬菌体作为模板进行PCR反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过进行实时定量PCR对样品中的病原进行定量。本方法检测病原简单灵敏且成本低廉，适用于病原感染的实验室诊断和血清流行病学调查。

主权项

1、一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，它包括下列步骤：A、特异性识别病原的重组噬菌体制备：从噬菌体抗体库中筛选特异识别病原的重组噬菌体/展示有识别病原抗原的单链抗体，或是从分泌识别病原的单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增抗体基因构建重组噬菌体，挑经鉴定阳性的单克隆培养过夜，然后二次活化至对数生长期，加入辅助噬菌体拯救，然后离心收集菌体，重悬于选择培养基中培养过夜，次日菌液离心，上清即为所需的噬菌体；B、特异性噬菌体的捕获，其步骤是：1)特异识别病原的单克隆抗体包被于酶标板；2)洗涤；3)封阻；4)洗涤；5)每孔加入样品以及阴性对照和阳性对照，孵育；6)洗涤；7)加入重组噬菌体上清，孵育；8)洗涤；9)每孔加入双蒸水，加热裂解结合的噬菌体，噬菌体的基因组DNA被释放出来作为PCR反应的模板；C、PCR检测：a.定性检测：以噬菌体的裂解液为模板，加入设计的上下游引物，进行PCR扩增，每个样品做两个重复，同时设不含有模板的蒸馏水作为PCR扩增的阴性对照，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶成像系统扫描；b.实时定量PCR进行定量检测：利用噬菌体的裂解液为模板，加入设计的上下游引物和TaqMan探针在定量PCR仪上进行实时定量PCR，在测定样品的同时，测定10倍稀释的不同浓度的病原抗原标准溶液，反应结束后用标准浓度测定的Ct值对浓度做标准曲线，再把测定样品的Ct值代入标准曲线即可算出样品中的病原的量。