[发明专利]一种快速定性检测红莲型细胞质的方法

摘要

本发明公开了一种快速定性检测红莲型细胞质的方法，该方法包括下列步骤，首先是红莲型细胞质雄性不育基因扩增PCR引物设计；其次是DNA的提取；第三是标准PCR扩增体系的建立；第四是扩增DNA片段检测分析；第五是核苷酸序列的分析。本发明方法简便，操作方便，该方法以红莲型细胞质雄性不育特有的分子标记为基础，快速、准确、可靠地通过实验室筛选水稻种质材料，使红莲型细胞质不育系的选育具有强烈的目的性和针对性，克服了传统育种方法的盲目性和低效、工作量巨大的缺陷，提高了新型配子体雄性不育细胞质的选育效率。

主权项

1、一种快速定性检测红莲型细胞质的方法，它包括下列步骤：A、PCR引物设计正向引物F：5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’；反向引物R：5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’；B、DNA的提取：首先取一段长1-2cm、宽0.5cm，重0.1克的水稻嫩叶及0.2克粉末状石英沙，依次放入一1.5ml离心管中，将叶片研磨成浆，加入500μlCTAB提取液，65℃水浴25-30min；其次是在水浴后的离心管中加入500μl氯仿/异戊醇/24∶1，混匀，离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管；第三是加入600μl无水乙醇/-20℃，混匀，4℃冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30μl无菌水即可。C、PCR扩增体系的建立：标准的PCR扩增反应体系为25μl，组成如下：总DNA/50ng 1μl10×PCR buffer/pH8.3 2.5μl25mM MgCl2 1μl25μm dNTP 1μl一单位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μl5pM的引物R 1μl去离子无菌水/ddH2O 16.5μl反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下：1cycle：94℃5min30cycle：94℃1min；55℃1min；72℃1min1cycle：72℃5minstore：4℃；D、扩增DNA片段检测：首先是扩增片段在1.5％的琼脂糖胶上电泳，用DNA Extraction kit纯化回收；其次是阳性细胞质的鉴定：(1)对照粤泰A有一条240bp的特异性扩增带，粤泰B为阴性，PCR结果可靠；(2)被检测材料的带型同红莲不育系粤泰A相一致时，该被检测材料为阳性，含有红莲型细胞质；被检测材料没有扩增带，该材料为阴性，不含红莲型细胞质；E、核苷酸序列分析：(1)在紫外透照仪上，用无菌刀片挖出琼脂糖凝胶上的目标带放入无菌Eppendorf管，用天平称量琼脂糖凝胶重量为1ml；(2)加入3倍体积的Binding Solution；(3)55℃水浴5-10min，直到琼脂糖凝胶熔化；(4)加入5μl硅胶溶液，DNA≥2.5μg，每增1μg DNA多加1μl硅胶液；(5)55℃水浴5min使DNA与硅胶结合，其间弹Eppendorf管使硅胶悬浮；(6)室温10000rpm离心20sec，去上清液；(7)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，弹硅胶悬浮；(8)室温10000rpm离心20sec，去上清液，用Washing buffer重复洗涤两次，风干沉淀；(9)用20μl TE或无菌ddH2O悬浮沉淀，55℃水浴5min使DNA释放入TE或ddH2O中；(10)室温14000rpm离心1min，吸取上清液，即得纯化的DNA片段，电泳检查回收纯化效果；(11)将回收片段根据Promega程序将回收的DNA克隆到pGEM-T载体上，挑选白色的阳性克隆，由上海联众基因有限公司进行DNA测序；(12)将获得的序列与红莲粤泰A的orfH79序列同源比对，扩增DNA序列与orfH79基因核苷酸的一致性。