[发明专利]甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法无效

专利信息
申请号: 200610019467.6 申请日: 2006-06-27
公开(公告)号: CN1884518A 公开(公告)日: 2006-12-27
发明(设计)人: 方小平;李均;王转;罗莉霞;李俊 申请(专利权)人: 中国农业科学院油料作物研究所
主分类号: C12N15/09 分类号: C12N15/09;C12N15/82;A01H4/00;A01H1/02;C12Q1/68
代理公司: 武汉宇晨专利事务所 代理人: 王敏锋
地址: 430062湖*** 国省代码: 湖北;42
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摘要: 发明公开了一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法,其步骤是:A.甘蓝农杆菌介导的遗传转化,首先是农杆菌菌液制备,其次是外植体制备,第三是将外植体置于农杆菌液中进行遗传转化,第四是除草剂抗性检测,第五是PCR分子检测;B.转基因甘蓝型油菜的人工合成,首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成,其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成,最后是对人工合成的单倍体油菜进行染色体加倍;C.转基因油菜的鉴定。本发明操作简单,外源目的基因可准确无误地转到甘蓝型油菜C染色体上,所获得的转基因油菜,环境释放时外源转基因扩散的生态风险小。
搜索关键词: 甘蓝 油菜 染色体 定向 转基因 方法
【主权项】:
1、一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法,该方法包括下列步骤: A、甘蓝农杆菌介导的遗传转化:首先是农杆菌菌液制备,将含有bar基因表达载体 pCAMBIA3300质粒的农杆菌菌株LBA4404划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养 基上,在28℃培养箱中倒置培养2-3天,待菌落长出后,从YEB平板上挑取一个单菌落, 接种于5mlYEB液体培养基中,置摇床上,培养过夜,取菌液划线接种于附加50mg/L卡 那霉素的YEB平板上,在28℃培养箱中倒置培养2天,见菌落长出后,将培养皿至于4℃冰 箱备用,在甘蓝转基因实验时,取一个单菌落接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养 基上,28℃培养1-2天,用1/2浓度的MS液体培养基洗下菌体,并将菌液稀释至OD600=0.08; 其次是外植体制备,将甘蓝种子消毒,植入1/2浓度MS培养基上生长4-5天,25℃、光16 小时/暗8小时,切下叶柄长1-2mm的子叶和长0.5-0.7cm的下胚轴分别作为具柄子叶和下 胚轴外植体;第三是遗传转化,将外植体置于农杆菌菌液中,22℃侵染5-10分钟,其间摇 动,在无菌吸水纸上吸干菌液,转至培养基MS+1mg/L2,4-D+0.2mg/L6-苄氨基嘌呤上, 22℃暗培养2-3天,然后转到培养基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO3+500mg/L羧苄青 霉素上延迟培养5-7天,再转到筛选培养基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO3+500mg/LCb +10mg/L草胺膦上培养3-4周,每2周转接一次,待再生绿苗长至1-2cm时,切下绿苗, 植入生根培养基上,待形成植株时,经炼茁移栽花盆中遮荫保湿培养;第四是除草剂抗性检 测,T0代转基因植株5-6片真叶期用13.5%的Basta1∶200倍稀释液喷施,转基因阳性植株 对该除草剂没有反应,表现除草剂抗性,转基因阴性植株在喷药5天后死亡;第五是PCR分 子检测,为避免T0代转基因植株的假阳性和农杆菌LBA4404污染,选取用草胺膦筛选呈阳性 的T0代株系植株进行剥蕾自交,获得T1代种子,将T1代种子种在网室,苗期用13.5%的Basta1∶200倍稀释液喷施,取抗性转基因甘蓝和非转基因甘蓝植株的幼嫩叶片,采用CTAB法提取 植物基因组DNA,然后用20ul反应体系对目的基因进行PCR扩增,设阴性对照以非转基因 甘蓝植株总DNA为模板和阳性对照以pCAMBIA3300质粒DNA为模板,反应程序为:95℃,2分 钟;94℃,30秒;50℃,30秒;72℃,1分钟,35cycles,72℃,5分钟,PCR产物用1%的 琼脂糖凝胶电泳进行检测,转基因阳性植株与阳性对照均扩增出500bp的条带,检测bar基 因所用的正向引物为:5′-GATCTCGGTGACGGGCAGGA-3′,反向引物为:5′-GGCGGT CTGCACCATCGTCAA-3′; B、转基因甘蓝型油菜的人工合成,首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成,以 白菜作母本、转bar基因甘蓝作父本进行种间杂交,取授粉7天后的子房,消毒用70%酒精 5~10秒、1%DICA消毒8~10分钟、无菌水洗3~4次后进行培养,培养基为MS培养基+ 500mg/L水解酪蛋白,待子房培养35~40天后,剥出子房中的种子,将剥出的种子接种在 MS培养基上萌发,直到长成苗,然后转接到生根培养基上生根和扩繁植株,待根系形成后, 经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养;其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成,以转bar 基因甘蓝作母本、白菜作父本进行种间杂交,取授粉17~20天的子房,消毒后,剥出杂种 胚,进行胚拯救培养,培养基为MS培养基+0.5mg/L6-BA,当胚上长出芽时,切下芽移 植到含0.01%秋水仙碱的MS培养基上,进行7-10天的培养,然后,将苗转入生根培养基中 生根,待根系发达时,移栽花盆中遮荫保湿培养,开花结果,收获种子;第三是染色体加倍, 对人工合成的单倍体油菜采取如下方法进行染色体加倍处理:a、切下幼苗移植于含0.01%秋 水仙碱的MS培养基上处理7~10天,取出苗,切去粘有0.01%秋水仙碱的MS培养基的茎基 部,转到生根培养基上生根和扩繁,每株系至少扩繁3株,待根系形成后,经炼苗移栽花盆 中遮荫保湿培养;b、秋水仙碱溶液浸根处理,将现蕾的植株从土壤中挖出来,洗净根部泥 土,将根浸泡在800mg/L的秋水仙碱水溶液中,4小时之后,用自来水冲洗根部2分钟, 移栽到田间,移栽成活后,剪掉已现蕾的主花序和分枝,使其产生新枝;c、油菜植株现蕾 时,将蘸有0.3%秋水仙碱的棉球置于植株的叶腋处,每天处理2次,连续处理3天; C、转基因油菜的鉴定: a、植株染色体数目观察,首先是种子萌发植株根尖观察法,将种子在10-15℃冷水浸泡 2-4小时,置湿润滤纸上于25℃下萌发,待根长至1~1.5cm时,取根尖在22℃下、0.002mol/L 8-羟基喹啉中处理3小时,用卡诺液固定24小时,然后置于70%乙醇中4℃下保存;其次是 幼小雌蕊观察法:剥取幼小花蕾中的雌蕊,用0.002mol/L8-羟基喹啉处理5小时,用卡诺 液固定24小时,然后置于70%乙醇中4℃下保存;第三是幼小花蕾观察法:将幼小花蕾用 0.002mol/L8-羟基喹啉处理4小时后,转到卡诺液中固定,24小时后转到70%乙醇中4℃下 保存; b、转基因油菜的除草剂抗性检测,人工合成油菜植株5-6叶期,喷施13.5%的Basta1∶200倍稀释液,5天后调查叶片药害表现,设非转基因油菜喷施对照,转基因油菜没有反 应,非转基因油菜枯死; c、转基因油菜基因组Southernblotting分子检测,采用CTAB法提取植物基因组DNA, 取人工合成的C染色体组转基因甘蓝行油菜、转基因甘蓝、非转基因油菜、非转基因甘蓝材 料基因组总DNA和转基因pCAMBIA3300质粒DNA各20μg,分别用内切酶EcoRI将其消化后 在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离,进行预杂交、杂交和洗膜的程序,所用探针为pCAMBIA3300 质粒PCR扩增bar基因的0.5kb片段,检测使用地高辛标记试剂盒进行,质粒、转基因油菜、 转基因甘蓝有特异带出现,转基因油菜与转基因甘蓝带型一致,非转基因油菜和甘蓝没有特 异带出现; d、外源基因位于甘蓝型油菜C染色体上的细胞遗传学验证,以转基因油菜作父本或母 本与白菜杂交,甘白杂种与白菜回交,获得回交一代种子,苗期对回交一代植株进行抗除草 剂涂叶鉴定,不抗除草剂植株叶片出现枯死症状时,将该叶片摘除,并对植株进行PCR分子 检测,根据抗除草剂表型和分子检测结果给每株挂抗、感牌,花期取每株幼小花蕾用 0.002mol/L8-羟基喹啉处理4小时,转到卡诺固定液中固定,24小时后转到70%乙醇中保 存备用,将幼小花蕾中的花药挑出,在60℃下、1M盐酸中解离5分钟,然后在改良卡宝品 红中进行染色、压片,在显微镜下观察、照相,观察到20条染色体的植株都是不抗除草剂, 并且PCR检测为阴性;染色体在21-28条之间的植株出现抗、感除草剂分离;染色体数为29 的植株抗除草剂,PCR分子检测阳性。
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