[发明专利]乳品中结核分枝杆菌的PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种实时荧光PCR检测乳品中结核分枝杆菌复合群的方法，为乳品生产中结核菌检测提供了有效手段，具有检测灵敏度高、特异性强的优点，用于奶牛结核的早期诊断克服了以往牛结核PCR检测取样难的缺陷。以乳液中加卡介苗作为模拟临床检测样本，对DNA提取方法进行改进，利用基于TaqMan技术的实时荧光PCR检测，选择分枝杆菌编码16sRNA基因和23sRNA基因之间ITS序列作为扩增靶序列。本发明的实时荧光PCR检测达到每毫升乳液检测10个结核分枝杆菌的灵敏度。本发明方法在乳品安全检测、公共卫生预防体系中的人畜共患结核病防治、奶牛结核病诊断等领域有重要应用价值。

主权项

1、一种乳品中结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR检测方法：其特征在于该方法包括下列步骤：(1)材料和方法菌株冻干粉卡介苗由上海市疾病预防控制中心提供，-20℃保存，按国家冻干皮内注射用卡介苗制造及检定规程规定：冻干菌苗菌数应在100万/mg以上，本发明使用的卡介苗每安瓿瓶5人份，含卡介菌0.2-0.3mg，菌数应在20万以上，卡介苗加1ml双蒸水溶解，溶解以后的菌液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000的稀释；模拟临床乳样本为检测样本采用50ul梯度浓度的稀释菌液混入450ul乳液中，乳液使用市售超高温灭菌纯牛奶，各检测样本为：溶液A：500ul乳液中包含50ul的1∶10稀释的卡介苗菌液，50ul菌液含菌数1000以上，终浓度1000个菌/0.5ml以上，溶液B：500ul乳液，卡介苗终浓度100个菌/0.5ml以上，溶液C：500ul乳液，卡介苗终浓度10个菌/0.5ml以上，溶液D：500ul乳液，卡介苗终浓度1个菌/0.5ml以上；引物、探针设计根据GenBank中分枝杆菌编码16sRNA基因和23sRNA基因之间ITS(internaltranscribed spacer)序列，使用OMIGA软件作序列比较后，使用OLIGO6.0，PRIMER5.0，BEACON软件设计一对特异性引物和特异性探针，PCR扩增产物为结核分枝杆菌复合群所特有，引物、探针由上海生工公司合成；菌株DNA提取对于不同梯度浓度的卡介苗稀释菌液，50ul稀释菌液直接加自产的结核分枝杆菌DNA提取液，100℃15分钟，13000rpm 2分钟，即可用来作PCR扩增；实时荧光PCR反应在50ul的反应体系中，加入7ul提取产物作模板，加混有引物的实时荧光PCR反应缓冲液30ul，加MgCl2 5ul，加荧光探针5ul，加混有UNG酶的Taq酶3ul，UNG酶可有效消除PCR扩增产物污染对实验的影响，在BioRad公司的icycler荧光PCR扩增仪的反应条件为：50℃2min；94℃5min； 93℃30sec，60℃1min，40个循环。