[发明专利]低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法

摘要

本发明公开了提供一种在血清检测中提纯低浓度或较难提纯的病毒用作检测抗原的方法。该制备方法主要包括一些生物学克隆技术和原核表达技术，对一些在寄主体内含量较低或较难提纯的病毒进行克隆，制备的方法取得该病毒的抗原，从而使得利用常规血清学检验方法检验出这些病毒抗原变为可能。

主权项

1、一种低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法，其特征在于它包含下列步骤：a)将烟草环斑病毒毒源摩擦接种白肋烟，1~2周后，取除根外的带毒株进行病毒的提纯；b)根据烟草环斑病毒的5个分离物的外壳蛋白CP基因的保守序列设计引物；c)从所述接种烟草环斑病毒的白肋烟叶片中提取RNA；d)RT-PCR扩增烟草环斑病毒的cDNA片段；e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，碱法提取质粒进行酶切后电泳分析原PCR产物并进行测序鉴定；f)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组质粒；g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内，挑取单克隆进行目的基因的小量表达；h)挑取单克隆进行目的基因的大量表达；i)将诱导前的样品、诱导后的样品和过柱后的样品分别进行纯化并进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度；j)以烟草环斑病毒抗血清为一抗，碱性磷酸酯酶标记的A蛋白为二抗，用NBT-BCIP显色，Western-Blot鉴定所提纯的蛋白作为抗原进行血清学检测。