[发明专利]一种人胰高血糖素样肽－1衍生物及其固相化学合成

摘要

一种具有人胰高血糖素样肽－1活性的人胰高血糖素样肽－1衍生物及其制备和应用，属于生物工程技术领域。该衍生物的分子结构式为以下的三种结构式：GLP－1(7－37)－Xaa38(Seq ID No.2)，GLP－1(7－37)－Xaa38－Xaa39(Seq IDNo.3)和GLP－1(7－37)－Xaa38－Xaa39－Xaa40(Seq ID No.4)之一，其中Xaa38，Xaa39和Xaa40分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。采用固相化学合成制备该衍生物。该衍生物具有长于GLP－1的半衰期；通过固相化学合成制备，生产步骤少，生产成本低，特别适于在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分。

主权项

1、一种GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，具体 操作步骤： (1)需用的带保护基的氨基酸单体共有17个，它们是： Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，其中缩写表示： Fmoc：9-芴基甲氧羰基 Boc：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl) Trt：三苯甲基(trityl) OtBu：叔丁基酯 tBU：叔丁基(tert-butyl) Pbf：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-苯磺酰基； (2)需用的仪器设备及试剂 仪器：SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号：SYMPHONY， 美国产品 试剂：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨 基吡啶(Dimethylaminopyridine)/DMFN，N-二异丙基乙胺(N， N-diisopropylethylamine)/NMP，HBTU100mmol/0.5MHOBTinDMF N，N-二环己基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP， 其中：DMF为N，N-二甲基甲酰胺 NMP为N-甲基吡咯烷酮 HOBT为1-羟基苯并三唑 HBTU为2-(1氢苯并三唑基)——四甲基脲六氟磷酸盐(2 -(1H-benzotriazole-y1-1，3，3-tetramethyl-Uronium hexafluorophosphate)； (3)操作： 第一步多肽树脂的合成 以0.25mmol规模为例，称取王氏树脂0.25g，置入SYMPHONY 型12通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取 1mmol装瓶，按GLP-1衍生物的氨基酸序列(SeqIDNo.2)从C- 端向N-端排列在所述的合成仪中，25℃下，由计算机程序控制自 动进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完 成合成，得到带侧链保护基的多肽树脂，在所述的合成仪上吹干、称 重； 第二步脱保护基及切断树脂 将第一步得到的带侧链保护基的多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加 入下列裂解试剂： 试剂 用量 水 EDT TIS 三氟乙酸 0.25mL 0.25mL 1mL 9.45mL ，然后在30℃下，电磁搅拌反应2小时，过滤，收集滤液，树脂用三 氟乙酸洗涤，合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀 用乙醚洗涤，干燥，得粗品； 第三步HPLC分离纯化、冷冻干燥 将第二步得到的粗品用制备型HPLC进行分离纯化，再经冷冻干 燥，得产品GLP-1衍生物。