[发明专利]降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法

摘要

本发明涉及一种降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法，首先利用限制性内切酶介导基因整合技术构建木霉菌突变株，通过对出发菌株及其转化子间氰化物降解酶系的活性比较分析，筛选出对氰化物高降解活性的木霉菌转化子，然后在确定了固相化过程中海藻酸钠和CaCl₂浓度、菌丝包埋量、固定化时间、降解温度与时间等因素的基础上，使用海藻酸钠作为载体包埋转化子细胞，制备固定化细胞小球，即为固定化木霉菌转化子。利用本发明制备的木霉菌转化子对含氰废水进行修复，其对氰化物的降解速度比游离细胞的降解速度要快，而且方便回收及再利用。

主权项

1、一种降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)木霉菌转化子的构建：采用质粒30-40μg、10U/μl的限制性内切酶HindIII10μl、STC山梨醇缓冲液200μl，配制成酶-质粒混合液；将浓度为106-108/ml的木霉菌原生质体悬浮液100μl与配制成的酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入浓度为60％2ml聚乙二醇，加入5ml预冷的STC，4℃下2000rpm离心15分钟，弃上清，加入3ml液体再生培养基，混匀，倒入无菌培养皿中，加入15-20ml已溶解好并冷却到45-55℃的固体再生培养基，20-25℃下放置6小时后，倒入含300μg/ml潮霉素的水琼脂10-15ml，平铺在再生培养基上，2-3天后出现转化子；将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基进行二次筛选，对正常生长的转化子进行5-7代PDA培养基培养后，再一次将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基上，将仍能正常生长的稳定的转化子接种到PDA斜面上，放在4℃冰箱中保存；其中，所述液体再生培养基的配制为：分别取硫酸铵2.8g，尿素600mg，硫酸钾4g，无水氯化钙600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，FeSO4·7H2O 10mg，ZnSO4.7H2O 1·8mg，MnSO4.H2O 3·2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，调节pH值至5.0；固体培养基则在液体培养基的基础上加入18-20g琼脂粉；2)转化子的硅胶粒保存：将经降解酶活性测定后得到的降解氰化物活性高的木霉菌转化子在28℃条件下置于PDA培养基培养，平板培养5-7天，使绿色孢子布满整个培养皿，取螺旋口玻璃管，放入硅胶粒到玻璃管体积的1/4-1/2，经干热灭菌处理后，冷却，使用前冰浴15-30分钟；取5％灭菌的脱脂牛奶0.5-2毫升加入培养皿中，水平摇晃，制成孢子悬液；用无菌移液管或枪吸取0.5-1毫升的孢子悬液，加到已冷却的玻璃管中的硅胶粒表面，盖上盖后，迅速摇动，使硅胶粒湿润并粘上孢子，立即放回冰浴，10-20分钟后，拧紧盖子放入4℃或-20℃冰箱中保存；3)菌丝的培养：取一粒上述浸润孢子悬液的硅胶粒，放置于倒有PDA的培养基上，培养5-7天后产生绿色孢子，挑取长有孢子的菌丝与5-6ml无菌水混合使混合溶液呈绿色，然后过滤，取3ml滤液放入50-100ml PDB液体培养基，在摇床中，28℃、100-140rpm下培养60-70小时；将培养好的菌丝过滤，并用0.7M的NaCl或无菌水将菌丝中培养基冲洗干净，得到绿色的湿菌丝体；4)固定化小球的制备：按2g-3g海藻酸钠、1g硅藻土置于100ml蒸馏水的比例，将海藻酸钠、硅藻土置于蒸馏水中，加热搅拌溶解并湿热灭菌，配制成海藻酸钠溶液；配制质量浓度为2-3％的CaCl2溶液，装于瓶中湿热灭菌，按每200ml海藻酸钠溶液中放入湿菌丝5克的比例，将湿菌丝放入灭菌后的海藻酸钠溶液中搅拌均匀，使用20-50ml注射器吸取菌丝混合液，用针头将其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并匀速搅拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小时，过滤得到固定化小球；用已灭菌的质量浓度为0.9％的NaCl溶液冲洗后，继续将小球放入体积浓度为0.1-0.3％的戊二醛溶液中进行交联30秒-2分钟，用无菌水冲洗后，得到制备好的固定化小球，即为固定化木霉菌转化子，4℃保存。