[发明专利]木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法

摘要

本发明涉及一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，首先通过产孢、菌丝培养以及采用崩溃酶酶液和山梨糖醇缓冲液处理，得到木霉菌菌株原生质体，然后将提取质粒DNA与制备的木霉菌原生质体混合，在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片段插入染色体组诱导插入突变，最后对突变的转化子进行筛选，得到比亲本生防效果更好的优良生物防治木霉菌突变株。本发明利用限制性内切酶介导的基因整合化技术可以得到大量的木霉菌转化子，并可从中筛选到对番茄灰霉病和黄瓜枯萎病等防治效果显著高于野生菌株的转化子，为扩大菌种资源，克隆生物防治基因资源，获得多功能生物防治菌株奠定基础。

主权项

1、一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，其特征在于包括如下具体步骤：(1)木霉菌菌株原生质体的制备：首先将木霉菌在PDA固体培养基上培养产孢后，用无菌水洗下木霉菌孢子，然后将木霉菌孢子加入PDB液体培养基中，在25-30℃下，100-150转/分摇床培养18-22小时，过滤收集菌丝，再用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝；将崩溃酶用0.7摩尔/升NaCl溶液配制浓度为13-20毫克/毫升的酶液，将上述得到的菌丝放入离心管，再将配制好的崩溃酶酶液以菌丝2倍体积的量加到离心管中，在25-30℃下以120-150转/分振荡培养3-4小时，然后过滤，并用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝，收集原生质体于离心管中，将离心管得到的原生质体溶液离心、去上清；然后重复向离心管中加入山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀、离心、去上清2-3次；再根据得到的原生质体的量向离心管中加入山梨糖醇缓冲液，调节原生质体浓度至107-108个/毫升；其中，所述山梨糖醇缓冲液的组分为：山梨醇316.256克、PH7.5的1摩尔/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl2 1.11g，加水定容到1000ml；(2)质粒提取与DNA消化：吸取含有质粒PV2的冷冻保存的菌种100微升，加到含有50微克/毫升的氨苄青霉素的100毫升的LB液体培养基上，37℃140-200转/分摇床培养12-16小时，取已培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液放于1.5毫升的离心管中，5000转/分离心5分钟，弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50毫摩尔/升葡萄糖，10毫摩尔/升乙二胺四乙酸，25毫摩尔/升Tris-HCl的溶液I进行悬浮沉淀，冰浴5-10分钟，再加入200微升含200毫摩尔/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含3摩尔/升醋酸钾，pH4.8的溶液III，混匀，冰浴5-10分钟；向离心管中加入450微升的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，10000转/分离心10分钟；吸取上清于另一离心管中，向其中加入与上清等体积的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，重复此抽提步骤2-3次；最后吸取上清于另一离心管中，向管中加入上清液的2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟，10000转/分离心10分钟，倒掉上清，向管中沉淀加入30-50微升10毫摩尔/升Tris.Hcl，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸配置的缓冲液，得到含有RNA的DNA溶液；向此溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升，37℃温育30-60分钟，去除RNA得到质粒DNA；其中，所述LB培养基的组分为：10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去离子水中，调节pH值到7.0，每瓶100毫升分装灭菌后备用；(3)转化：在50毫升离心管中加入质粒40微克、浓度为10个单位/微升限制性内切酶HindIII10微升、山梨醇缓冲液200微升，配制成酶-质粒混合液，然后向离心管中加入100-200微升原生质体悬浮液，并使其与酶-质粒混合液混匀，置冰上15-20分钟，缓慢向管中加入2毫升聚乙二醇，冰浴20-25分钟，然后将离心管取出在28℃下放置10-20分钟，加入5毫升预冷的山梨醇缓冲液，4℃下2000转/分离心15分钟，弃上清，加入3毫升液体再生培养基，25-30℃下放置6小时；然后将培养液倒入培养皿中，加入15毫升预先熔化并冷却至50℃的固体再生培养基，混匀后冷却干燥，熔化水琼脂，并冷却至50℃，加入潮霉素至浓度为300微克/毫升，快速倒入平板中，在28-30℃下，培养4-5天，将能够抗潮霉素的菌落转移到预先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固体PDA培养基上进行二次筛选，能够继续生长的菌落为得到的木霉菌转化体；其中，所述液体再生培养基的组分为：(NH4)2SO4 2.8克、尿素600毫克、磷酸钾4克、葡萄糖40克、蔗糖100克、CaCL2 600毫克、MgSO4.10H2O 200毫克、FeSO4.7H2O 10毫克、ZnSO4.7H2O 1.8毫克、MnSO4.H2O 3.2毫克、CoCL2.6H2O 4毫克；所述固体再生培养基的组分是在液体再生培养基组分的基础上，再加入琼脂17-20克。