[发明专利]高效液相色谱和质谱联用快速筛选血管紧张素转化酶抑制剂的方法

摘要

本发明公开了一种用高效液相色谱和质谱联用快速筛选血管紧张素转化酶抑制剂的方法。以马尿酸双甘肽或马尿酸组氨酸亮氨酸为底物，以纯化的兔肺血管紧张素转化酶或者非乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的人血浆为血管紧张素转化酶的来源。本方法较普通的分光光度法或者高效液相色谱法简单、快速、高效。单个样品的总检测时间或者血浆样品的血管紧张素转化酶活力的分析时间不到原有方法的二分之一。可适用于快速分析天然产物提取物、单体以及上市的血管紧张素转化酶抑制剂在体外对血管紧张素转化酶的抑制情况，而且可用于人血浆中血管紧张素转化酶活力的快速分析。

主权项

1.高效液相色谱和质谱联用快速筛选血管紧张素转化酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)底物的配制：用pH＝8.3的缓冲液配制4~8毫摩尔/升的马尿酸组氨酸亮氨酸溶液或用pH＝8.0的缓冲液配制4~8毫摩尔/升的马尿酸双甘肽溶液；(2)酶的配制：用pH＝8.3和pH＝8.0的缓冲液分别配制纯化的兔肺血管紧张素转化酶溶液(0.1U/毫升)；冷冻的非乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的人空白血浆于37℃水浴中解冻后，直接使用；(3)底物和酶反应：准确移取40微升4~8毫摩尔/升马尿酸组氨酸亮氨酸或马尿酸双甘肽溶液、2毫U纯化的兔肺血管紧张素转化酶溶液或非乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的人空白血浆(40微升)及待测样品或缓冲溶液(10-20微升)，于37℃水浴中反应8-16分钟；(4)反应样品分析：将反应液过滤膜或离心后，用高效液相色谱对血管紧张素转化酶反应混合溶液中底物、产物以及所加内标进行分离后，在电喷雾质谱的负离子模式下检测；所述高效液相色谱的条件如下：流动相：乙腈∶0.1％乙酸水溶液＝1∶4(体积比)色谱柱：250×4.6毫米(大连江申)流速：1.0毫升/分钟检测波长：228纳米进样量：10微升所述质谱条件如下：离子源：电喷雾电离负离子模式毛细管电压：3500伏特锥孔电压：23伏特离子源温度：120℃脱溶剂气温度：270℃锥孔气流速：60升/小时脱溶剂气流速；350升/小时射频透镜(RF Lens)电压：0.5伏特。