[发明专利]诺瓦克病毒和轮状病毒多重RT－PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的多重RT－PCR检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过提取样品病毒核酸，经PCR扩增、电泳及PCR产物序列测定，结果如出现392bp扩增条带，证明该样品存在轮状病毒；如果出现318bp扩增条带，则证明该样品存在诺瓦克病毒。本发明还相应地建立了检测试剂盒，可特异性强、灵敏、高效地同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒，适用于处理大通量的样品，可以推广应用到环境检测、食品卫生领域、商品检验检疫等领域。

主权项

1、一种同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的检测方法，主要包括以下步骤：(1)提取病毒核酸：a.取一定量的样品，加900uL Trizol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min；b.加入200ul氯仿，用力振摇15S，再静置2～3min；c.4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；d.加入500uL异丙醇，充分混匀，室温放置10min；e.4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；f.加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；g.4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；h.充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中。(2)PCR扩增：多重PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1μL，2mmol/L dNTP 2.5μL，0.3-0.5μmol/L轮状病毒上游引物和下游引物各1μL，0.3-0.5μmol/L诺瓦克病毒上游引物和下游引物各1μL，1.5U TaqE1.5μL，25mmol/L MgCL2 2.5μL，模板2.5μL，加DEPC水至25μL。将反转录和扩增反应的所需试剂一次性加入反应管内，两次反应在一个反应管内完成，整个实验过程无须开盖。扩增条件：采用降落PCR进行扩增，条件为：变性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火温度每降低1℃2个循环，10个循环后退火温度降至为50℃进行20个循环，共30个循环后，72℃延伸10min。(3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物5ul，制备1.4％的琼脂糖凝胶直接进行电泳，以Gold view染料替代0.5μg/mL EB，凝胶成像分析系统UV I观察结果。(4)结果分析：如果出现392bp扩增条带，证明该样品存在轮状病毒；如果出现319bp扩增条带，则证明该样品存在诺瓦克病毒。