[发明专利]特异检测牛疱疹病毒Ⅰ型的LUX荧光引物和核酸扩增方法

摘要

本发明公开了牛疱疹病毒I型(BHV－1)特异的LUX(Light Upon Extension)荧光PCR引物序列和实时荧光PCR检测方法。本发明以BHV－1病毒的gpC基因为目标基因，设计和筛选BHV－1特异的单标记自身淬灭LUX荧光引物和对应的配对引物。采用BLAST软件对引物序列的分析结果表明，两条引物序列与数据库中的所有BHV－1病毒对应序列完全吻合，与其他动物病毒序列无明显相关性。本发明对实时荧光扩增反应退火温度和时间、镁离子浓度、引物浓度进行优化，采用优化的反应条件和熔解曲线结果判定方法，进行了特异性和敏感性试验，证实方法特异、敏感。可在2小时内准确检测到拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、精液、体外细胞培养物等样品中的BHV－1病毒，检测敏感性比常规凝胶PCR方法可提高达10⁴。目前国内外应用的BHV－1感染检测技术耗时长、敏感性、特异性不理想。本发明提供了一种新的快速准确的BHV－1检测技术。

主权项

1、牛疱疹病毒I型(BHV-1)病毒特异的LUX荧光核酸扩增引物和配对引物。两条引物根据BHV-1病毒gpC基因序列，应用专业软件设计和筛选得到，用于建立LUX实时荧光PCR方法快速、准确检测BHV-1病毒。其中，反向引物为LUX荧光引物，除gpC基因序列外，还含有能形成发夹结构的核苷酸序列，并标记FAM荧光基团。两条引物的序列如下：正向引物：5’CGACGCTACGCCAGAGGA 3’反向引物：5’CACGAGGTAACGGGCGGGTCGTG 3’。