[发明专利]用等温分支扩增检测对虾白斑综合症病毒的试剂盒及方法

摘要

提供一种用等温分支扩增(RAM)检测对虾白斑综合症病毒(WSSV)的试剂盒，特别是提供一对检测WSSV特异性标记探针，进一步提供一种使用该试剂盒检测WSSV的方法；试剂盒包括DNA提取试剂、杂交液C、探针捕获试剂、洗涤液F、连接液G、等温分支扩增(RAM)反应液H、显色剂I；检测WSSV的方法包括(1)WSSV的DNA提取，(2)WSSV的等温分支扩增，(3)显色检测。本发明采用RAM技术，特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，可用于对虾各生长发育阶段的WSSV检测。

主权项

1.一种用等温分支扩增方法检测对虾白斑综合症病毒的试剂盒，其试剂包括：(1)DNA提取试剂：含组织裂解液A和DNA吸附液B；组织裂解液A含有4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1M的β-巯基乙醇；DNA吸附液B为50％吸附磁珠悬浮液；(2)杂交液C：杂交液C含有2M异硫氰酸胍、0.5％牛血清白蛋白、80mM乙二胺四乙酸、400mMTris-HCl pH7.5的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、0.5％十二烷基肌氨酸钠、2-10nM WSSV-C-探针和20-100nM WSSV-捕获探针；(3)探针捕获试剂：包括磁珠D和探针捕获液E；磁珠D是浓度为4mg/ml的链亲和素免疫磁珠；探针捕获液E含有10mM pH7.5的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、1mM乙二胺四乙酸和1-2MNaCl：(4)洗涤液F：含有10mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸和1mM乙二胺四乙酸；(5)连接液G：含有1×连接液缓冲液和10-20活性单位的Taq DNA连接酶；1×连接酶缓冲液含有20mM pH7.6的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、25mMKAcO、10mMMgAcO、10mM二硫苏糖醇、1mM二氢尿嘧啶脱氢酶和0.1％曲拉通X-100；(6)等温分支扩增反应液H：含有10×Thermopol反应缓冲液、200-1000uMdNTP、0.8-1.5uM正向引物Prime-1、0.8-1.5uM反向引物Prime-2、5-15U Bst DNA聚合酶和50-200ngT4噬菌体基因32编码蛋白；10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mMKCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％曲拉通X-100；(7)显色剂I：为1％的荧光染料SYBR GREEN I；其中杂交液C中的WSSV-C-探针序列为：5’-磷酸-GGGTGACAAGTTGGGCGGAAATGTCCTTGTCTGTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCTCGGAGCAGTGGGCCAGACGGATAATAT；杂交液C中的WSSV-捕获探针序列为：5’-生物素-AAGAAAGATGTTGTTGATGAAAAGACCCGCAATACTGGCAATGGT；等温分支扩增(RAM)反应液H中的正向引物Prime-1序列为：5’-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT；等温分支扩增(RAM)反应液H中的反向引物Prime-2序列为：5’-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC。