[发明专利]检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及方法

摘要

本发明提供一种用等温分支扩增检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的试剂盒，它包括DNA提取试剂、杂交液C、探针捕获试剂、洗涤液F、连接液G、等温分支扩增反应液H、显色剂I；特别是提供一对检测传染性皮下及造血组织坏死病毒的标记探针。进一步提供一种使用试剂盒检测IHHNV的方法。本发明特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需价廉的恒温金属浴(价格仅为PCR仪的5－10％)或恒温水浴即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，可直接使用荧光染料，通过肉眼观察来判定检测结果，简单而快速。可广泛用于科研，特别是养殖现场的IHHNV的检测。

主权项

1.一种用等温分支扩增方法检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其试剂包括：(1)DNA提取试剂：含组织裂解液A和DNA吸附液B，组织裂解液A含有4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1M的β-巯基乙醇；DNA吸附液B为50％磁珠悬浮液；(2)杂交液C：杂交液C含有2M异硫氰酸胍、0.5％牛血清白蛋白、80mM乙二胺四乙酸、400mM pH7.5的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、0.5％十二烷基肌氨酸钠、2-10nM IHHNV-C-探针和20-100nMIHHNV-捕获探针；(3)探针捕获试剂：包括磁珠D和探针捕获液E，磁珠D是浓度为4mg/ml的链亲和素免疫磁珠；探针捕获液E含有10mM pH7.5的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、1mM乙二胺四乙酸和1-2MNaCl；(4)洗涤液F：含有10mM pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸和1mM乙二胺四乙酸；(5)连接液G：含有10-20活性单位的Taq DNA连接酶和1×连接酶缓冲液，1×连接酶缓冲液含有20mM pH7.6的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、25mMKAcO、10mMMgAcO、10mM二硫苏糖醇、1mM二氢尿嘧啶脱氢酶和0.1％曲拉通X-100；(6)等温分支扩增反应液H：含有5-15U Bst DNA聚合酶、10×Thermopol反应缓冲液、200-1000uMdNTP、0.8-1.5uM正向引物Prime-1、0.8-1.5uM反向引物Prime-2和50-200ng T4噬菌体基因32编码蛋白；10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mMKCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4和1％曲拉通X-100；(7)显色剂I：为1％的荧光染料SYBR GREEN I；其中杂交液C中的IHHNV-C-探针序列为：5’-磷酸-CAGCAAAGGTAACTCCCAAATAGGCGATGTCTGTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCGTAGTCGCTTCAGCTTCGGCTCTGG；杂交液C中的IHHNV-捕获探针序列为：5’-生物素-AAGATACGAAAGCCGTTCAATACCGTATCTGATAAGATAGAGTAT；等温分支扩增反应液H中的正向引物Prime-1序列为：5’-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT；等温分支扩增反应液H中的反向引物Prime-2序列为：5’-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC。