[发明专利]一种鸡精原细胞分离纯化方法

摘要

一种鸡精原细胞分离纯化方法，涉及转基因、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。本发明先分离鸡精原细胞，然后进行Percoll分离、贴壁纯化，本发明首次对不同时期鸡胚的睾丸，比较以组合酶和Percoll介质梯度的分离方法，并依据睾丸细胞不同贴壁特性进行纯化，以探索合适的鸡精原细胞分离方法、时期、及精原细胞纯化的可能性。通过从鸡睾丸组织中分离出精原细胞，并经过Percoll梯度离心和贴壁纯化方法进一步对鸡精原细胞进行纯化，能制备出睾丸细胞数和存活率都较高的生精上皮细胞悬液，而且还能确保去除睾丸中其它体细胞成分。

主权项

1、一种鸡精原细胞分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：1)分离鸡精原细胞：无菌收集出雏后3～15日龄公鸡睾丸，置于预热的无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液中，去除附睾、脂肪垫及白膜，将组织分成小块，在磷酸盐缓冲液中吹打，静置后去上清液，沉淀的组织块用1mg/ml胶原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶三步消化或1mg/ml胶原酶+1.5mg/ml透明质酸酶/0.25％胰蛋白酶二步消化或1mg/ml胶原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶二步消化后，制成单细胞悬液。2)Percoll分离、贴壁纯化：将单细胞悬液滴加到Percoll梯度上层，离心，将形成的细胞条带置于另一试管中，加入磷酸盐缓冲液稀释Percoll，用离心方法去除上清液，将试管中的沉淀物用DMEM培养液悬起，最后将细胞吹打均匀后，接种到用0.1％明胶预处理过的培养板中，在37℃±2℃、5％CO2条件下培养24h～36h后，弃去旧的培养液；然后用磷酸盐缓冲液清洗1～2次，最后再加入新鲜DMEM。