[发明专利]转聚磷激酶基因的大肠杆菌的构建方法无效
| 申请号： | 200610038917.6 | 申请日： | 2006-03-17 |
| 公开（公告）号： | CN1876809A | 公开（公告）日： | 2006-12-13 |
| 发明（设计）人： | 杨柳燕;王勤;赵庆顺;肖琳;蒋丽娟;尹大强;任晶 | 申请（专利权）人： | 南京大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/52;C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19 |
| 代理公司： | 南京苏高专利事务所 | 代理人： | 柏尚春 |
| 地址： | 210002江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种转聚磷激酶基因的大肠杆菌的构建方法，该方法包括基因的克隆和载体的构建；克隆包括：提取大肠杆菌的总DNA；设计引物，扩增ppk基因；扩增出的目的基因重组到克隆载体pMD18－T中；转化大肠杆菌DH5α；构建包括：采用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切带有ppk目的基因的pMD18－T质粒和空表达载体pET－28a(+)；将目的基因通过T4连接酶定向连接到表达载体pET－28a(+)中，然后转化DH5α；利用PCR和双酶切的方法筛选鉴定出阳性重组子；提取出重组质粒pET28a－PPK，转化受体菌株BL21(DE3)中。本发明工艺简单，所得基因菌具有高效的去除磷的能力。 | ||
| 搜索关键词： | 转聚磷 激酶 基因 大肠杆菌 构建 方法 | ||
【主权项】：
1、一种转聚磷激酶基因的大肠杆菌的构建方法，其特征是该方法包括ppk基因的克隆和表达载体的构建；其中ppk基因的克隆包括以下步骤：(1)提取大肠杆菌的总DNA；(2)根据已知的E.coli基因序列设计引物，以总DNA为模板，利用多聚酶链反应技术扩增ppk基因；(3)扩增出的目的基因重组到克隆载体pMD18-T中；(4)转化大肠杆菌DH5α即得到ppk基因；表达载体的构建包括以下步骤：(1)采用限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切带有ppk目的基因的pMD18-T质粒和空表达载体pET-28a(+)；(2)将目的基因通过T4连接酶定向连接到表达载体pET-28a(+)中，然后转化DH5α；(3)利用PCR和双酶切的方法筛选鉴定出阳性重组子；(4)提取出重组质粒pET28a-PPK，转化受体菌株BL21(DE3)中，即可完成了转聚磷激酶基因的大肠杆菌的构建。
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