[发明专利]松树脂溃疡病菌的分子检测方法

摘要

本发明涉及一种松树脂溃疡病菌的分子检测方法，利用引物设计软件Prime 5.1，设计一对镰刀菌IGS片段上的通用引物G1/G2和特异性引物S1/S2，以松树病菌样品DNA提取液为模板，进行第一轮的通用引物PCR扩增反应；随后PCR扩增产物稀释100倍，取1μl作为模板，进行第二轮的特异引物PCR扩增反应。扩增产物进行电泳检测，如果存在873bp的DNA特异性条带，则确定所检测的的病菌为松树脂溃疡病菌。用本方法检测松树脂溃疡病菌，只需一个工作日的时间，检测灵敏度达到最低限量病菌DNA浓度为5×10^－3pg/μl，分生孢子10个/100μl。本法可直接从土壤、木材以及种子中快速、灵敏、准确检测松树脂溃疡病菌，特别适合于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。

主权项

1.松树脂溃疡病菌的分子检测方法，其特征是检测方法如下：①.提取松树病菌样品的DNA，-20℃下保存备用；②.根据GenBank公布Fusarium属IGS序列，利用引物设计软件Prime 5.1，设计一对镰刀菌核糖体基因内间隔区IGS片段上的通用引物G1/G2，其序列为：G1：5’-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3’G2：5’-ACTCACGGCCACCAAACCA-3’③.根据松树脂溃疡病菌及其近缘种、相关种IGS差异，设计一对能鉴别松树脂溃疡病菌的特异性引物S1/S2，其序列为：S1：5’-CTTACCTTGGCTCGAGAAGG-3’S2：5’-CCTACCCTACACCTCTCACT-3’④.利用特异性引物S1/S2和通用引物G1/G2，进行松树脂溃疡病菌巢式PCR扩增步骤如下：第一轮，通用引物PCR扩增：反应体系总体积为25μl，反应组分为：10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上、下游通用引物G1、G2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，模板松树病菌样品DNA提取液1μl，灭菌水补足25μl；扩增反应程序为：95℃变性5min，进入循环，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环后72℃延伸10min；第二轮，特异引物PCR扩增：反应体系总体积为25μl，将第1轮PCR扩增产物稀释100倍，取1μl作为模板；其它反应组分为：10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl2 1.5μl，10pmol/L上游引物S1、下游引物S2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，灭菌水补足25μl；反应程序为：94℃变性3min，进入循环，94℃变性35s，66℃退火55s，72℃延伸50s，40个循环后72℃延伸12min；⑤.扩增产物进行电泳检测：取10μl扩增产物，采用1.2％的琼脂糖凝胶，在电压80V下电泳20～40分钟后在紫外灯下检测，如果存在873bp的DNA特异性条带，则确定所检测的的病菌为松树脂溃疡病菌。