[发明专利]人谷胱甘肽－S－转移酶Pi的纯化方法及其该酶的应用

摘要

本发明公开了一种人谷胱甘肽－S－转移酶Pi的纯化方法，其方法步骤为：(1)将含表达载体pET－28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接种于LB固体培养基，振荡培养，离心收集菌体；(2)按每g菌体沉淀加入pH7.9的结合缓冲液重悬收集菌体沉淀，经超声破碎、离心后取上清液，用缓冲液洗脱；(3)将洗脱上清用透析液1透析去咪唑，再用透析液2透析测定酶活性；(4)用PBS缓冲液透析，用凝血酶水解切割His₆标签，获得人谷胱甘肽－S－转移酶hGSTpi。本发明方法纯化得到的hGSTpi重组蛋白纯度高，且空气氧化形成的无活性二聚体少，hGSTpi在炎症治疗中的应用，不仅能有效控制炎症，而且对机体免疫系统的影响小，副作用极小。

主权项

1、一种人谷胱甘肽-S-转移酶Pi的纯化方法，其纯化步骤如下：(1)、将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接种于含卡那霉素100mg/L的LB固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，用去离子水定容至1升，37℃振荡培养12h，挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/L LB液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃振摇培养16h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃振摇培养2～4h，OD600达到0.5～0.6时，加异丙基β-半乳糖甘至终浓度为0.4mM，继续振摇培养4h，12,500g离心10min收集菌体；(2)、按每g菌体沉淀加5mL 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，PH7.9的结合缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，12,500g，4℃离心15min后取上清，上清与经结合缓冲液预平衡过的IDA-Ni2+树脂在4℃结合40min，用以上结合缓冲液洗涤柱3次，再用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，PH7.9的洗涤缓冲液洗涤2次，用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，PH7.9的洗脱缓冲液洗脱3次；(3)、合并3次洗脱液上清，用0.5M NaCl，20mMTris-HCl，PH7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸钾，1mM EDTA，PH6.5透析液2透析测定酶活性；(4)、用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS缓冲液透析测定蛋白浓度，用凝血酶水解切割His6标签，得到人谷胱甘肽-S-转移酶hGSTpi。