[发明专利]高活性凝血酶抑制剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法，以凝血酶的天然特异抑制剂水蛭素为改造对象，应用DNA家族改组技术，将水蛭素HV1、HV2、HV3基因进行改组，构建水蛭素噬菌体展示的改组文库，以凝血酶为包被抗原，对噬菌体改组库进行3轮“吸附、洗脱、扩增”的富集淘选，再经ELISA筛选得到多个与凝血酶具有高亲和力的噬菌体单克隆。对这些克隆进行原核诱导表达，检测纯化表达产物的抗凝血酶活性，获得抗凝血酶活性较天然的水蛭素更强的水蛭素蛋白。采用本发明所制备的高活性凝血酶抑制剂具有以下优点：1)抗凝血酶活性更强，疗效显著；2)分子量小，不具有免疫原性；3)安全，无明显毒副作用。

主权项

1、一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法，其特征在于：按下述步骤进行：1)根据凝血酶抑制剂的基因序列，选择水蛭素HV1、HV2、HV3作为改造对象，采用分段合成寡核苷酸片段，互补寡核苷酸片段退火配对后，经PCR扩增而获得目的基因。2)取等量的上述3种纯化后的PCR产物，用DNaseI消化，回收50bp左右片段，经无引物PCR进行随机组装，有引物PCR扩增，回收目的片段，获得水蛭素的DNA家族改组基因。3)将DNA家族改组基因定向克隆入经SfiI和NotI双酶切的噬菌体表达载体pCANTAB5E中，转化E.coli TG1细胞，加入M13K07辅助噬菌体进行超感染，获得水蛭素的噬菌体改组文库。4)以凝血酶为包被抗原，对噬菌体改组库进行3轮“吸附、洗脱、扩增”的筛选，随着包被抗原浓度的不断降低，洗涤次数及洗涤力度的不断加强，改组文库中凝血酶特异的水蛭素突变体得到了有效富集。5)扩增第3轮筛选所得的噬菌体克隆，用ELISA鉴定各噬菌体单克隆与凝血酶的结合活性，获得能与凝血酶产生高亲和力结合的阳性克隆。6)将ELISA筛选出的阳性噬菌体感染HB2151，加入IPTG诱导表达，提取菌体的周质提取液，经HiTrap Anti-E Tag亲和纯化柱进行纯化，ChromozymTH为发色底物，测定其水蛭素变异体抑制凝血酶的活性，得到高活性的凝血酶抑制剂。