[发明专利]伊维菌素人工抗原的合成新方法

摘要

本发明伊维菌素人工抗原的合成新方法，其特征包含半抗原4″－O－(单)－琥珀酰IVM的合成和采用N－羟基琥珀酰亚胺酯法合成人工抗原。本发明通过多次对偶联条件实验，成功以多聚赖氨酸PLL(MW3～8万)为载体合成了4″－O－(单)琥珀酰IVM－PLL，作为人工免疫原，为进一步研究IVM酶联免疫残留分析法创造了条件。

主权项

1、一种伊维菌素人工抗原的合成新方法，其特征包含半抗原4″-O-(单)-琥珀酰IVM的合成和采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法合成人工抗原：1)半抗原4′-O-(单)-琥珀酰IVM的合成第一步：用叔丁基二甲基氯硅烷将琥珀酰IVM的C5-OH选择性保护取1.0g IVM用6ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，机械搅拌下，加入0.47g咪唑和0.52g t-BuMe2SiCl，以1ml DMF预溶解，25℃搅拌2.5h后，反应液与100ml的乙酸乙酯混合，50ml蒸馏水洗涤，收集乙酸乙酯层，反复水洗3次，减压浓缩酯层；残余物以1ml二氯甲烷复溶；经200-400目硅胶柱GF254分离产物，洗脱液为CH2Cl2∶THF，其体积比100∶2，TLC监控反应，收集Rf为0.47的组分；减压浓缩，真空干燥后，得白色粉末；反应式为：IVM+t-BuMe2SiCl→5-t-BuMe2SiO-IVM+HCl第二步：在IVM C4″-OH部位构建间隔分子和活性基团取0.5g 5-t-BuMe2SiO-IVM溶解于10ml的二氯甲烷中，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶，0.5ml三乙胺和0.90g琥珀酸酐，在磁力搅拌条件下，回流2.5h，反应液变为黑褐色。通过减压方式除去反应液中的二氯甲烷，残留物用100ml乙醚重溶后过滤，滤液以3.6％盐酸20ml和蒸馏水50ml洗涤醚层，水洗反复3-5次，使pH为中性；收集醚层蒸干，以1ml二氯甲烷复溶，用GF254 TLC方法分离产物，展开剂为CH2Cl2∶THF∶CH3OH，其体积比位95∶5∶5，收集Rf为0.5的组分，以甲醇淋洗，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得淡黄色粉末；反应式为：5-t-BuMe2SiO-IVM+C4H4O3→5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM第三步：去保护，得到C4″-O-(单)琥珀酰IVM取5-r-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM 0.3g用17ml甲醇溶解，25℃磁力搅拌下加入10ml甲醇溶解的0.2g对甲基苯磺酸，25℃磁力搅拌25min后，加入100ml的乙酸乙酯，混匀后，用50ml的2％NaHCO3洗涤，再以蒸馏水洗涤3-5次，至pH中性；收集酯层减压浓缩，用二氯甲烷1ml复溶残留物，以GF254TLC方法分离产物，展开剂为CH2Cl2∶THF∶HAC，其体积比为90∶9.7∶0.3，收集迁移率(Rf)为0.2的组分，以乙酸乙酯淋洗，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得淡黄色粉末；反应式为：5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM+C7H8O3S→4″-O-琥珀酰IVM(2)人工抗原的合成采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法合成人工抗原第一步：取10.0mg制备的人工半抗原4″-O-(单)琥珀酰IVM置5ml圆底烧瓶中，加1.0ml DMF溶解，再依次加入2.5mgNHS和4.5mg EDC·HCL，混合后，在室温下磁力搅拌10h；第二步：在15ml三角瓶中加入5.4ml 0.2mol/L pH9.0缓冲液为硼酸盐，0.6ml DMF，混匀后，将25mg多聚赖氨酸(PLL)溶解于其中；第三步：将第一步反应液在0.5h内逐滴加入第二步配制的溶液中，在25℃下搅拌1h后，转至4℃下搅拌6h；第四步：第三步产物装入截止分子量为3500的透析袋内，透析液为0.01mol/L的PBS，pH7.2，每隔12小时更换1次透析液，透析72小时；取出透析袋，放入盛有聚乙二醇6000的烧杯中，将透析袋的水份吸干；第五步：用Sephacryl S-200纯化，利用紫外吸收光谱对半抗原与载体蛋白的连接进行鉴定，经计算其结合比为1∶29，得到较纯IVM人工抗原，在-20℃下冻存。