[发明专利]兔病毒性出血症病毒荧光定量检测方法

摘要

兔病毒性出血症病毒荧光定量检测方法，属于动物疫病诊断检测方法技术领域。常规PCR方法基本实现了快速、灵敏地诊断兔病毒性出血症病毒的目的，但传统的分子诊断方法存在操作繁琐、费时、易污染、非特异性高及定量困难、易出现假阳性等缺陷。该发明的技术方案为：采用TaqmanMGB探针，通过比对兔病毒性出血症病毒VP60基因，设计一对保守的特异性引物和一条特异的MGB探针。利用反应中荧光信号的有无来判定病料中有无感染兔病毒性出血症病毒。它的优点是：利用该兔病毒性出血症病毒荧光定量检测方法解决了兔病毒性出血症的诊断难题，该方法能实时定量的检测到各临床病料中的兔出血症病毒含量，并适用于出口兔产品的快速检测。

主权项

1、兔病毒性出血症病毒荧光定量检测方法，其特征是：1、设计一对特异性引物和探针：Forward Primer(P1)：ACTGGTCGCGGCTGTGAT；Reverse Primer(P2)：CCTCCAACCCTGGTCCAAT，荧光探针为FAM 5’CCACCAGGCATCGA-3’MGB；2、核糖核酸(RNA)的提取：在250μl病毒浓缩液中加入750μl裂解液，振摇15s，室温放置5min；加入200μl氯仿，振摇15s；室温放置10min；4℃，10,000rpm离心15min，取上层水相于另一离心管中加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min；4℃，12,000rpm离心12min，沉淀RNA；小心弃净上清，用冰冷的75％乙醇1ml洗涤沉淀，混悬后12,000rpm离心20min，小心弃净上清超净台内风干RNA沉淀；用DEPC处理水10μl溶解沉淀，并加入1.5μl RNA酶抑制剂，5μl/管分装，冻存或立即反转录；3、反转录：将所提RNA每个样品中加2μl反转录缓冲液、0.5μl脱氧核糖核苷酸混合液；0.5μl随机引物；0.25μl反转录酶加DEPC水至10μl；42℃10～15分钟，95℃2分钟，反转录成cDNA；4、聚合酶链式反应(PCR)：每个反应管中加入25μL反应缓冲液，特异性上游引物和下游引物各加1ul，探针2ul；阳性对照加阳性质粒4ul；ROX内参1ul；cDNA加4ul；阴性对照用去离子水代替；加灭菌蒸馏水至50ul；5、反应参数：95℃10s；95℃5s，60℃31s，72℃10s，40循环；72℃2min；在每一循环60℃退火步骤读取荧光信号；将反应管装入定量PCR仪中启动反应；6、结果判定：阳性对照的CT值应小于28，阴性对照CT值应大于35；CT值小于等于30，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在RHDV，判为阳性；CT值在30-35之间视为可疑，应重复试验，若仍在此范围内判为阴性。