[发明专利]抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备方法及抗体和用途

摘要

本发明公开一种用于检测O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法、以及这种抗体和这种抗体的用途。

主权项

1、抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征是：(1)用BHK-21细胞增殖O型口蹄疫病毒，并收集病毒液，将收集的病毒液冻融数次，使细胞充分裂解，让病毒充分释放出来，再用BEI灭活处理经离心分离除去细胞碎片后，在所得液体内加入按每升液体80克加入PEG6000和每升液体40克的NaCl，搅拌均匀后静置过夜，再经离心处理沉淀出病毒，用含量为0.1M Tris，0.5M NaCl，0.05M EDTA，pH7.6的TNE悬浮沉淀，使其体积为原体积的1％，再加入2倍体积的三氯乙烯去脂，再进行离心处理，吸取上清液重复进行离心处理，再用与前述比例相同的TNE重悬沉淀，在重悬液中加入0.2g/L的脱氧胆酸钠，混匀后静置过夜，将过夜的粗抗原液经蔗糖梯度离心分离得到纯化的O型口蹄疫病毒抗原，(2)用所得O型口蹄疫病毒抗原与等量佐剂充分乳化后注入小鼠皮下，注射剂量为每次20～80μg/抗原，间隔2～4周，同法重复注入至少1次；第一次免疫用完全弗氏佐剂、第二次改用弗氏不完全佐剂、第三次不用佐剂，经最后一次免疫后的2周后待用，取小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0细胞系的骨髓瘤细胞待用，(3)细胞融合：将20～80μg的纯化O型口蹄疫病毒抗原向已按步骤(2)的方式免疫接种的小鼠腹腔或静脉接种免疫，在免疫后的3天后，取血清抗体效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合，然后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞后按体积比1∶30加入1640培养液，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，将上述(2)中培养的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀。用1640培养液悬浮上述皮细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比(5～10)∶1混合两种细胞，然后离心去除上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，再静置1～2分钟后离心去除上清液，再加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液悬浮融合细胞，最后补加HAT培养液至沉淀物体积的140～160倍进行培养，取Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL经高压灭菌过的液体石蜡，7-10天后按1-5×106个杂交瘤细胞/小鼠的量注入小鼠腹腔，注射后7-10天后进行无菌操作腹水采集，采集的腹水用离心法弃去最上层的脂肪层，收集中间层液体，即为单克隆抗体，再进行纯化处理得到高纯度的抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体。