[发明专利]猪附红细胞体PCR检测方法

摘要

本发明提供一种猪附红细胞体PCR检测方法，所用试剂包括PCR检测试剂盒，及含有目的基因片段重组质粒的阳性对照、阴性对照、Taq酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液，通过被检样品DNA提取、PCR扩增及扩增产物分析达到检测目的。本发明提供的方法可快速、准确地检测出被检样品中的附红细胞体，也可用于猪附红细胞体病的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，可排除镜检时细菌和杂质颗粒的干扰，从而大大提高诊断准确率，降低假阳性率。

主权项

1.猪附红细胞体PCR检测方法，其特征是通过以下技术方案实现：(1)被检样品DNA提取：取200μl无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存备用；(2)设置PCR检测试剂盒：由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液组成，其中，PCR试剂管含10×缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物1、引物2及MgCl2，引物1和引物2具有的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列：SEQ ID NO 15’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’SEQ ID NO 25’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’；(3)PCR扩增：在PCR试剂管中加入处理后的样品DNA，同时设阴、阳性对照，每管加入Taq酶不少于0.2μl，混匀后稍离心，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件为95℃5min，94℃60s，60℃30s，72℃60s，共35循环，最后在72℃后延伸7min；(4)扩增产物分析：将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检样品孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照比对，以判定样品为猪附红细胞体阳性或阴性。