[发明专利]脂质体包裹弓形虫pGRA4真核表达质粒的方法及用途

摘要

本发明提供一种脂质体包裹弓形虫pGRA4真核表达质粒的方法，采用改进的脱水－再水化法制备脂质体，即在冷冻干燥过程之前和之后分别加入需包裹的真核表达质粒，可提高对真核表达质粒的包裹率，并且在使用前以冻干方式保存脂质体，使用时再水化，可提高构建脂质体的稳定性，减少构建的脂质体不稳定对包裹造成的影响。本发明提供的脂质体包裹弓形虫pGRA4真核表达质粒，有效的提高了小鼠的细胞免疫水平，可在制备提高动物免疫保护药物中应用。

主权项

1.一种脂质体包裹弓形虫pGRA4真核表达质粒的方法，通过以下方案实现：(一)构建pcDNA3-致密颗粒蛋白4真核表达质粒：从复苏的弓形虫RH株中提取DNA，并通过聚合酶链反应方法合成致密颗粒蛋白4基因片段后，分别用华美生物工程公司的KpnI和EcoRI双酶切经凝胶纯化的致密颗粒蛋白4基因片段和pcDNA3载体，经T4DNA连接酶处理后，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，挑取转化菌单菌落培养后提取质粒，碱裂解法收集大量pcDNA3-致密颗粒蛋白4真核表达质粒，聚乙二醇沉淀法纯化pcDNA3-致密颗粒蛋白4真核表达质粒DNA；致密颗粒蛋白4基因扩增引物：5`-CGC GGG TAC CAT GCA GGG CAC TTG GTT TTC-3`和5`-CGC GGA ATTCTC ACT CTT TGC GCA TTC TTT-3`，(二)通过改进的脱水-再水化法构建脂质体，并包裹弓形虫pcDNA3-致密颗粒蛋白4真核表达质粒：将磷脂酰胆碱、1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺按16∶8∶4混合，溶于氯仿，旋转蒸发至氯仿完全蒸干后，加入1ml含100mgpcDNA3-致密颗粒蛋白4真核表达质粒的磷酸盐缓冲液，4℃振荡3小时使之完全混溶，冷冻干燥24小时后可见一块状白色多孔固体，使用时再加入1ml含50mg pcDNA3-致密颗粒蛋白4真核表达质粒的磷酸盐缓冲液水化。