[发明专利]一种适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法

摘要

本发明公开了一种适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法，采用以AOT即二(2－乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的非连续胶电泳系统，本系统能够快速有效地分离分子量在1－70Kda范围内的蛋白和多肽并测定其分子量，尤其适于分离分子量在1－10Kda的低分子多肽，具有较高地灵敏度和分辨率，且操作简便，耗时短，成本低。本系统克服了传统十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)不适于分离低分子多肽的缺陷，可广泛应用于低分子肽的分离纯化和分子量测定。

主权项

1.一种适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法，采用以AOT即二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的非连续胶电泳系统，其特征是：浓缩胶缓冲液：1mol/LTris-HCl，pH6.8；分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCl，pH8.8；浓缩胶浓度为T＝3％，分离胶浓度为T＝10～16.5％，交联度C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素；所述胶的制备与一般SDS-PAGE电泳胶的制备方法相同；电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲系统，其配方为：0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3，并添加0.1％AOT；样品缓冲液为pH6.8，其配方为：1.6ml浓缩胶缓冲液+4ml 10％AOT+0.6g二硫苏糖醇+2.5ml87％甘油+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml；其中含有的2％AOT能使多肽样品充分变性；变性条件依样品的分子量和性质，选用60℃孵育10min或75℃孵育10min或95℃孵育5min或者100℃煮沸3min；使用70mm*80mm*1mm的小胶板进行电泳；电泳条件：将电极缓冲液注入电泳槽中，先60V恒压，待样品进入分离胶界面时，升电压至120V～140V，电泳时间1.5-2h；若使用160mm*160mm*1mm的大胶板进行电泳；电泳条件：将电极缓冲液注入电泳槽中，先80V恒压，待样品进入分离胶界面时，电压升至160-200V，电泳10-12h；电泳完毕后，将胶置于固定液中固定1h，然后放置于染色液中染色过夜，转至脱色液中脱色，并多次更换脱色液，直至胶背景清晰；其中所述固定液由20％三氯乙酸配制；所述染色液配方为：0.29g考马斯亮蓝R-250+250ml脱色液；所述脱色液配制方法为：250ml95％乙醇+80ml冰醋酸+蒸馏水定容至1000ml。