[发明专利]类天蚕素A－马盖宁杂合基因工程抗菌肽

摘要

本发明涉及类天蚕素A－马盖宁杂合基因工程抗菌肽，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA，CA)N端第1－7个氨基酸残基，马盖宁(magainin，M)N端第2－12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1－7)－M(2－12)基因，同载体pPICZα－A连接后，利用点突变技术对其进行突变得到了突变体pPICZα－CA－Mu－1、pPICZα－CA－Mu－2、pPICZα－CA－Mu－3；转化毕赤酵母受体菌SMD1168，在醇氧化酶启动子调控下，分子量约1.9kD的类CecA－Mag杂合抗菌肽获得表达来开发研制相关的基因工程产品。

主权项

1、类天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽是由以下制备方法得到的：1)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因合成选取Genbank上登录号为X06672的天蚕素A(CecA)成熟肽段1-7个氨基酸和Genbank上登录号为J03193的马盖宁(Mag)成熟肽段2～12个氨基酸，设计两个引物片段F1和F2，以F1序列和F2序列片段互为模板和互为引物进行SOE法PCR扩增，获得合成的CecA-Mag杂合肽基因；引物F1，SEQ.ID.NO.1：5‘CCTCTCGAGAAAAGAAAGTGGAAGCTGTTCAAGAAGATCGGTCCAGGTAAG3’引物F2，SEQ.ID.NO.2：5’TAGTCTAGACTAGAACTTCTTGGCACTGTGCAGGAACTTACCTGGACCGATCTTCTT3’PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl2，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；引物F1和引物F2，终浓度为20pmol/L各2μL；TaKaRaExTaqTM 0.5μL；灭菌超纯水，38.5μL；PCR反应条件：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃30s，退火温度从65℃降至50℃，每循环1min，每个循环降低0.5℃，72℃1min，共30个循环后温度降至50℃，再在最适退火温度52℃的条件下进行15个循环；72℃延伸6min，经过胶回收后获得天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因；2)类天蚕素A-马盖宁杂合肽母体基因酵母表达载体的构建上述PCR产物和pPICZαA均用XhoI、XbalI双酶切，T4 DNALigase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行缺失酶切位点鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pPICZα-CA；3)重组表达载体pPICZα-CA的转化感受态毕赤酵母，SMD1168，80μL与SacI线性化的重组表达载体5μg相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现；采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮--冻--煮法制备PCR模板，设计引物：P3，SEQ.ID.NO.3：GTCTCCACATTGTATGCTTCP4，SEQ.ID.NO.4：CTGTGCAGGAACTTGAT反应体系同上，PCR反应条件：94℃5min；94℃45s；48℃45s；72℃45s，25个循环；72℃6min；扩增出大小为406bp的克隆定为pPICZα-CA阳性转化子；4)重组毕赤酵母菌在摇瓶中的诱导表达将筛选到的阳性转化子接种到5mL BMGY中，30℃230r/min振荡培养约22h至OD600 达到3～6；室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mLBMMY培养基，进行诱导表达28℃，250r/min培养60h，期间每24h补加终浓度为1％的甲醇；72h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的天蚕素A-马盖宁杂合基因工程抗菌肽产物。