[发明专利]5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度的测定方法

摘要

本发明涉及一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒可以是干粉状态，在使用前溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、α-酮戊二酸、腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、还原型辅酶及稳定剂，这些成分可以配成单剂试剂盒、双剂试剂盒及三剂试剂盒；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度大小，从而测算出5’-核苷酸酶活性的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

主权项

1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：腺苷单磷酸+水 5’-核苷酸酶 腺苷+单磷酸盐腺苷+水 腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸 +辅酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+ 过氧化氢将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’-核苷酸酶活性浓度大小测定结果。腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作为作用酶，功能为将腺苷酶解产生氨。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶：谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶变成为辅酶，在340nm波长下发生吸光度下降，从而可以测算出5’-核苷酸酶活性浓度。还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。