[发明专利]一种猪α干扰素重组腺病毒及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种猪α干扰素重组腺病毒及其构建方法，其构建方法步骤如下：猪α干扰素IFN－α基因的扩增、克隆；含有IFN－α基因的重组穿梭载体的构建；重组腺病毒质粒载体的构建；重组腺病毒的获得。本发明还公开了猪α干扰素重组腺病毒在制备抗病毒疫苗中的应用。该重组腺病毒能在体内有限生长并且不断表达IFN－α蛋白，使猪具有持久的抗病毒感染的保护力，在病毒的防治方面具有广阔的应用前景。

主权项

1、一种猪α干扰素重组腺病毒的构建方法，其特征在于步骤如下：(1)猪α干扰素基因的扩增、克隆：根据GenBank猪IFN-α1基因序列及相关假基因序列设计两对引物，其中引物P1、引物P2扩增基因前半段F片段，引物P3、引物P4扩增后半段B片段；两段基因间有37bp的重复序列；在引物P1中引入了Nde I酶切位点，引物P4中引入了EcoR I酶切位点，在引物的5’端分别含限制性内切酶酶位点；所述引物序列如下：P1：5’-CTC ATA TGT GTG ACC TGC CTC AGA-3’；P2：5’-TTG CCC CCA AAA GCC TCA-3’；P3：5’-GGA CTT TGG ATC CCC TCA TG-3’；P4：5’-CAG AAT TCA GAA TGG GCT TGT TAG-3’；提取猪肝组织的DNA作模板，扩增猪α干扰素基因，PCR产物与克隆载体pMD18-T连接；连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pMD-IFN-α进行酶切、测序鉴定；(2)含有IFN-α基因的重组穿梭载体的构建：用核酸限制性内切酶Sal I和核酸限制性内切酶Xba I将重组质粒pMD-IFN-α中的猪α干扰素基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV载体的核酸限制性内切酶Sal I和Xba I两酶切位点间，获得含有IFN-α基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-IFN-α；(3)重组腺病毒质粒载体的构建：将重组穿梭载体pAdTrack-CMV-IFN-α、腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用核酸限制性内切酶Pme I线性化后转化含腺病毒骨架载体Adeasier-1的BJ5183感受态细胞中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，将外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-IFN-α；(4)重组腺病毒的获得：将重组腺病毒质粒pAdCMV-IFN-α用核酸限制性内切酶Pac I酶切线性化后，经脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞包装成重组腺病毒rAdCMV-IFN-α。