[发明专利]一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片

摘要

本发明公开了一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片，其步骤首先是以尼龙膜为载体，其次是设计引物和探针，第三是芯片点阵布控，最后是芯片点样和固定。该芯片监控系统由碱基突变位点的阴性对照、阳性对照和平行对照组成；检测系统为待检的mtDNA 45个位点的野生型和突变型探针。每张芯片包含90条探针、196个样点，布控合理、规整度高。实验操作流程简单，省时，成本低，仅需1次不对称PCR扩增、1次生物素标记、1次杂交反应，即可检测mtDNA45个位点。检测结果准确、快速、效率高，可满足不同层次医院的要求，适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。

主权项

1、一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片，它包括下列步骤：A、以尼龙膜作为载体：剪1.5cm×2cm的尼龙膜，放入灭菌DdH₂O浸泡10min，再浸入5×SSC 30min，取出，风干，4℃保存备用；B、设计引物和探针：首先从MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中国期刊网和重庆维普数据库中检索与糖尿病相关的线粒体基因/mtDNA突变位点；其次是以mtDNA剑桥序列/GenBank #J01415.0 gi：337188为序列，采用PrimerPremier 5.0和NCBI BLAST软件，针对mtDNA45个突变位点，设计特异性扩增目的DNA序列引物和野生型及突变型寡核苷酸探针，退火温度为56.7℃～62℃，在5′或3′端修饰8个多聚T；C、芯片点阵布控：膜芯片为196个样点组成的14行×14列的矩阵，包括监控系统和检测系统，监控系统为：①芯片阴性对照，为探针稀释液5×SSCBuffer，布控在有公共野生型探针的位点处，点样矩阵中，mtDNA 3200、3205与3206位点公用1条野生型探针，点样矩阵中，mtDNA 3200，3205与3206位点公用1条野生型探针，在mtDNA 3200和3205位点的突变型探针点样处下方，点印阴性对照；②芯片阳性对照，标记生物素的mtDNA 3243位点的野生型和突变型探针按1∶1比例混合的25μM溶液，设计布控在膜芯片的4个角，共16个阳性对照样点；③芯片平行对照，采取25μM的探针溶液，于各位点平行点印2个点，在矩阵点样中，对mtDNA 1888位点的野生型探针和突变型探针，各点印2个样点，共4个样点检测1个基因位点；检测系统由mtDNA 45个位点的野生型和突变型寡核苷酸探针，设计布控样点组成，每条探针采用5×SSC Buffer稀释为25μM溶液，同时点印2个平行点，共4个样点检测1个基因位点，45个基因位点按照从左到右从小到大的顺序排列；D、芯片点样固定：监控系统与检测系统点阵布控在同一区域，采用478A芯片点样仪，点印于经灭菌双蒸水和5×SSC Buffer预处理后的尼龙膜条；紫外线照射8min交联固定，4℃保存备用；所述的特异性野生型和突变型寡核苷酸探针：所述的目的DNA序列引物：  引物  编号      序列，5′→3′扩增范围产物长度  7 F：  TCCAAAGACAACCATCATTCC R：  GATTGATGAAAAGGCGGTTGA14470-14944475bp