[发明专利]飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法

摘要

本发明公开了一种飞秒激光融合红发夫酵母原生质体的方法，属于细胞融合技术。该方法采用飞秒激光显微操作系统实施，其过程包括，对数期红发夫酵母用含二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液预处理；用由葡聚糖酶、氯化钾和氯化钙的水溶液组成的酶液，制原生质体；将原生质体与聚乙二醇、氯化钾、氯化钙和磷酸盐缓冲液组成融合液，并加入荧光素双醋酸酯；以5～20mW的光镊为工具，实现荧光较强两目标原生质体接触；调整激光光束的焦点对准两原生质体细胞膜紧密接触区，50～100mW照射67.5～250ms；两目标原生质体完全融合后，分离，培养。本发明细胞融合率高，融合后细胞的活性高，融合子易于检出以及能对融合过程进行实时监控和记录。

主权项

1.一种飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法，该方法采用飞秒激光显微操作系统实施，所述飞秒激光显微操作系统包括：飞秒脉冲激光器、光束耦合装置、倒置显微镜和监控系统；所述飞秒脉冲激光器为掺钛蓝宝石自锁模飞秒激光振荡级，输出脉冲重复频率大于70兆赫兹，脉冲宽度小于100飞秒；光束耦合装置包括一个焦距为150毫米的凸透镜、两个平面反射镜及可旋转偏振片和快门装置；倒置显微镜主体基于奥林巴斯公司生物倒置显微镜；监控系统包括目镜以及与计算机相连的CCD相机，进行红发夫酵母细胞的融合，其特征在于包括以下过程：1)将收集的对数生长期的红发夫酵母细胞，置于含有30～70mmol/L二硫苏糖醇和20～60mmol/L乙二胺四乙酸的pH为7.2的磷酸盐缓冲液中，于18～25℃处理10～30min，离心分离，收集红发夫酵母细胞；2)将经步骤1)预处理后的细胞加入到由质量百分比为1～4％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液组成的pH为8的高渗酶液中，于18～25℃处理5～20小时，离心分离，用含0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液洗涤去除葡聚糖酶，收集红发夫酵母原生质体；3)将步骤2)所制得的红发夫酵母原生质体转到含有质量百分比为1～10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的pH为7.2的磷酸盐缓冲液组成的溶液中，红发夫酵母原生质体浓度为2.5～12.5×106/mL，向融合液中加入荧光素双醋酸酯，融合液中的荧光素双醋酸酯浓度为0.1mg/ml，将融合液加入融合池后，置于显微镜的载物台上；4)在荧光显微镜下观察原生质体的荧光，选择一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为融合目标1，对所选中的目标1红发夫酵母原生质体施加功率为5～20mW的激光，捕捉固定，再选择另一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为另一融合目标2，由计算机控制显微镜的载物台的前后和左右移动，实现目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体的靠近，直至目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体接触，再控制显微镜的载物台的前后和左右移动，使激光焦点所在的轴线与目标1和目标2的红发夫酵母原生质体细胞膜紧密接触的区域对中，再调节物镜焦距，使光束焦点在上下轴线方向与目标1和目标2的两原生质体细胞膜紧密接触的区域对中后，采用功率为50～100mW的飞秒光束，照射细胞膜紧密接触区域67.5～250ms；5)待目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体经过150～180分钟后，融合成一个大的细胞后，再用玻璃微管将此由融合得到的细胞转移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白冻、3g/L酵母粉、3g/L麦芽汁和质量百分比为1.5％的琼脂组成的固体培养基平板上，22℃培养，观察，当平板上出现菌落时说明细胞成活，融合成功。