[发明专利]一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法

摘要

一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种三维条件下动态扩增干细胞的技术。其特征是在中空纤维膜内用I型胶原凝胶包埋骨髓间充质干细胞，然后将此细胞在气升式环流生物反应器中进行培养，收获骨髓间充质干细胞。本发明的效果和益处是，I型胶原凝胶为骨髓间充质干细胞提供了优良的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长；中空纤维膜可使细胞避免受到流体剪切力的作用及相互之间的碰撞，从而消除流体流动所带来的损伤；气升式环流生物反应器能够有效降低培养体系的传质阻力，使细胞具有充足的养分供应，有利于骨髓间充质干细胞的扩增。

主权项

1.一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于以下步骤：(1)提供骨髓间充质干细胞：兔股骨来源的骨髓间充质干细胞以5×105cells·mL-1的密度接种于含20％胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞在培养瓶底达80％融合时，加入含0.02％EDTA浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养；(2)准备中空纤维膜：将内径与外径分别为0.8mm与1.4mm的亲水性聚偏氟乙烯中空纤维膜反复清洗后，121℃灭菌30min；(3)I型胶原凝胶包埋骨髓间充质干细胞：将含有3ng·mL-1bFGF浓度为3mg·mL-1的I型胶原溶液加入一定细胞数量的兔骨髓间充质干细胞悬液中，调整细胞密度为5×105cells·mL-1，接种于聚偏氟乙烯中空纤维膜内，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内2小时，在膜内形成含有细胞的凝胶；(4)准备气升式环流生物反应器：用清洗剂及软刷清洗气升式环流生物反应器的各个部件，超纯水冲洗三遍；装配好反应器的主体部分，将主体部分及连接好的管路包裹好，121℃灭菌30min，烘干；(5)在气升式环流生物反应器中，三维动态培养骨髓间充质干细胞：将包埋骨髓间充质干细胞的I型胶原凝胶膜组件接种至气升式环流生物反应器内，加入含20％胎牛血清、3ng·mL-1bFGF的DMEM培养基，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内，打开气泵开关，调节气体流量，使培养液在环流生物反应器内充分循环起来；(6)酶解凝胶，收获骨髓间充质干细胞：采用浓度为2.5％的I型胶原酶37℃下酶解I型胶原凝胶20min，1200rpm离心5min，收获骨髓间充质干细胞。