[发明专利]天然抗菌剂－重组鸡－β防御素Gal－9－Gal－8双分子蛋白的制备方法

摘要

本发明提供的是一种天然抗菌剂－重组鸡－β防御素Gal－9－Gal－8双分子蛋白的制备方法。本发明采用分子生物学技术，从鸡体内分别克隆到鸡－β防御素Gal－8与Gal－9基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸡－β防御素Gal－9－Gal－8双分子蛋白。重组鸡Gal－9－Gal－8双分子蛋白：1)能抑杀大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌，2)抗鸡传染性支气管炎病毒与新城疫病毒，3)经鸡口服后1周后，提高免疫鸡血清中抗鸡传染性支气管炎病毒抗体水平10－20％，新城疫病毒抗体水平10－20％，提高鸡脾淋巴细胞转化率60－70％。

主权项

1、一种天然抗菌剂-重组鸡-β防御素Gal-9-Gal-8双分子蛋白的制备方法，其特征是：(1)根据已发表的鸡-β防御素Gal-8与Gal-9基因序列设计特异性引物，Gal-9：上游引物：5’-GGA TCC CCG GAA TTC ATG CAG ATCCTG CCT CTC-3’，下游引物：5`-TCA GGA ATA CCA TCG GCT CCG GCAGCA GAA-3`。Gal-8：上游引物：5′-gga tcc atg aag atc ctc tgc ctg ctcttc-3`，下游引物：5′-gaa ttc ctg cgc cgg aat ctt ggc aca gc-3′；(2)采用RT-PCR方法从鸡舌组织中扩增鸡β防御素Gal-9基因，并克隆到PMD-T载体上，基因序列为：AAGCTTGGGAATCTCTAAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCCGCTCACAATTCCACACAACATACC其中：阴影部分为目的基因序列，其余为载体，方框内为引物，斜体分别为起始密码子与终止密码子；(3)采用RT-PCR方法从鸡肝脏组织中扩增鸡β防御素Gal-8基因，隆到PMD-T载体上，得到鸡-β防御素Gal-8基因，基因序列：AATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGG其中：阴影部分为目的基因序列，其余为载体，方框内为引物，斜体分别为起始密码子与终止密码子；(4)根据鸡-β防御素Gal-9基因序列特点，用EcoRI和SalI双酶切位点将Gal-9基因亚克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中，构建重组表达载体PGEX-6p-1-Gal-9，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆，小量法提取质粒进行酶切和PCR鉴定；(5)根据重组子PGEX-6p-1-Gal-9与Gal-8基因序列特点，用NotI与SalI双酶切位点将Gal-8基因克隆到原核表达载体PGEX-6p-1-Gal-9中，构建重组表达载体PGEX-6p-1-Gal-9-Gal-8，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆，小量法提取质粒进行酶切和PCR鉴定；(6)含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+LB培养基中37℃振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导4小时后采1ml菌样，并于4℃、5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，煮沸5分钟，冰浴2分钟；(7)经亲和层析柱纯化回收Gal-9-Gal-8蛋白。