[发明专利]一种快速生产糖蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种快速生产糖蛋白的方法，该方法利用分子生物学技术构建含有多聚组氨酸和目的糖蛋白编码基因的表达载体，并通过电转化法转入盘基网柄菌中，在含碳源，氮源，磷酸盐的培养基中培养，带有多聚组氨酸残基的糖蛋白在盘基网柄菌中经过糖链修饰后分泌表达到培养介质中，通过Ni亲和树脂层析方法获得糖蛋白产品。本发明方法简便，快速，成本低，具有推广应用价值。

主权项

1.一种快速生产糖蛋白的方法，包括以下步骤：(1)重组表达载体的构建利用PCR克隆出糖蛋白基因并同时在基因上添加多聚组氨酸编码序列与Mlu I、Bgl II酶切位点编码序列，经Mlu I、Bgl II酶切后回收小片段，插入经相同酶切的盘基网柄菌表达载体pMB74，获得目标糖蛋白的重组表达载体，命名为pMB74-H；(2)重组盘基网柄菌株的构建将上述的重组表达载体pMB74-H电转化到经电转化缓冲液重悬的盘基网柄菌株中，在电转化培养基中培养3～8天，通过G418抗性筛选获得重组盘基网柄菌：其中电转化缓冲液配方为：15～18g/L蔗糖，1.82g/L磷酸钠，调节pH6.5；电转化培养基配方为：8～12g/L葡萄糖，4～6g/L酵母膏，4～6g/L蛋白胨，2～3g/L胰蛋白胨，2～3g/L蛋白胨，1.2g/L K₂PO₄，0.35g/L Na₂HPO₄，15～100μg/LG418，调节pH为6～7；(3)糖蛋白在重组盘基网柄菌中表达将上述重组盘基网柄菌，接种于发酵培养基中，21～23℃培养3～5天，摇床转速为50～150转/分；其十发酵培养基配方为：8～12g/L葡萄糖，12～18g/L氮源，1.2g/L K₂PO₄，0.35g/L Na₂HPO₄，10～100pg/L G418，50μg/L硫酸链霉素，100μg/L氨卞青霉素；(4)糖蛋白的分离用离心的方法除去发酵液中的菌体，再用2.0～4.5μm滤膜抽滤，将滤液通过Ni亲和树脂进行亲和层析得到目标糖蛋白。