[发明专利]一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法

摘要

本发明公开了一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它采用如下步骤：1)以叶片为受体材料，建立蝴蝶兰外源基因转化的受体系统；2)进行抗生素敏感性试验，获得本底指标；3)转化农杆菌，培养农杆菌菌株；4)对蝴蝶兰受体材料进行预培养后，将外植体和农杆菌在无任何抗生素的诱导培养基上共培养5天；5)在诱导培养基上添加较低浓度的抗生素，抑制农杆菌的快速生长，将上述共培养的叶片，在此诱导培养基上共培养2－3星期；6)转化体的筛选和增殖；7)转化株的再生和分子检测。

主权项

1、一种提高外源基因在蝴蝶兰上转化的农杆菌脱菌法，它采用如下步骤：步骤一，以叶片为受体材料，建立蝴蝶兰外源基因转化的受体系统；步骤二，进行抗生素敏感性试验，获得本底指标；步骤三，取蝴蝶兰的脱毒无菌苗生理状态良好的叶片，剪去叶片边缘，再将叶片剪成四周都有创口，以利于携有外源目的基因的农杆菌侵染和附着，叶片经处理后，植入诱导培养基，叶片在近轴面朝下进行预培养；步骤四，制作农杆菌感受态细胞，转化农杆菌，从转化的农杆菌中，随机挑选单菌落，进行农杆菌培养；步骤五，将农杆菌液置平衡，然后从培养瓶中取出预培养好的叶片，浸入菌液中浸染，取出放入培养皿中并吸出多余的菌液后，将浸染后的叶片，放在预培养基上，将细菌和外植体置于暗培养室中培养，在诱导培养基上添加抗生素，抑制农杆菌的快速生长，将上述共培养的叶片在此诱导培养基上培养；步骤六，将上述共培养的叶片用含头孢霉素的液体培养基冲洗干净后，转移到含抗生素的筛选培养基中，在暗培养室中继续培养，在筛选过程中一直加入抗生素，当肉眼不可见农杆菌出现时，除去头孢霉素，当叶片边缘肉眼可见淡黄色颗粒型胚性愈伤组织时，可将淡黄色颗粒型胚性愈伤组织小心切下，转移到相同培养基上在光培养下进行增殖；步骤七，当颗粒型胚性愈伤组织增殖后，转到分化培养基上，诱导幼芽分化，当幼芽长到一定程度时，转入生根状苗培养基中培养。待根系长成后，一部分出瓶练苗，并移栽到水苔中，于温室中培养，一部份直接用于分子检测。