[发明专利]制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法

摘要

一种制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，特别是涉及纳豆激酶表达载体的构建、表达和纯化工艺，解决了一般的基因工程重组表达的方法导致纳豆激酶以包涵体的形式出现在表达产物当中的问题。本发明方法包括表达全长的带有前导肽的纳豆激酶基因以提高活性，加入重要的分子伴侣PDI帮助蛋白正确折叠、利用GST标签提高蛋白可溶性、利用硫酸铵沉淀法快速提纯产品、加入HIS蛋白标签帮助产物进一步纯化等等。这样的纳豆激酶产品纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。产物可以制作药物或者口服保健品，利于向大众推广，成为新一代的溶栓产品。

主权项

1.一种制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于：构建含有前导肽序列的纳豆激酶基因克隆，加入GST蛋白标签和PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，以及生物活性的鉴定，具体方法为：1)以Bacillus Subtilis Natto菌体为模板，根据纳豆激酶(Nattokinase，简称NK)全长序列设计引物，通过PCR的方法获得包含前导肽的全长纳豆激酶基因，称为proNK；在proNK基因的3′末端增加HIS标签序列(六个连续的组氨酸，HIS6)，再将proNK加HIS标签的基因克隆进入pGEX-6P载体；接着利用PCR将分子伴侣PDI的全长基因克隆出来接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶切位点序列(序列用pp表示)，这样组装成为高效表达载体pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，简称6pNHP；相应表达出的重组蛋白为GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI；2)6pNHP转化大肠杆菌Rosseta，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；然后将两种菌体按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值，低温振荡使PPase将重组蛋白酶切完全，释放出proNK蛋白，从而得到高浓度的含有纳豆激酶的溶液；进行蛋白定量分析和活性测定；4)将含有纳豆激酶的溶液进行纯化处理。