[发明专利]一种利用动物乳腺生产抗人CD20单克隆抗体的方法

摘要

本发明提供了一种利用动物乳腺生物反应器生产抗人CD20单克隆抗体的方法。采用本发明所述的方法生产抗人CD20单克隆抗体的表达量显著高于采用哺乳动物细胞系的表达量，而且所得的嵌合抗体特异结合人B淋巴瘤细胞表面抗原CD20的能力也高于采用哺乳动物细胞系表达得到的抗体，生产成本较之采用哺乳动物细胞系来生产显著降低，可产生巨大的经济效益和社会效应。

主权项

1、一种利用动物乳腺生产抗人CD20单克隆抗体的方法，其特征在于它包括下述步骤：(1)合成鼠抗人CD20单克隆抗体的重链可变区序列，插入到含有人免疫球蛋白γ重链恒定区的pCγ载体中，构建得到抗CD20人鼠嵌合抗体的重链乳腺表达载体pBC1-HuG1F；(2)合成鼠抗人CD20单克隆抗体的轻链可变区序列，插入到含有人免疫球蛋白κ轻链恒定区的pCκ载体中，构建得到抗CD20人鼠嵌合抗体的轻链乳腺表达载体pBC1-HuK1F；(3)用NotI和SalI分别双酶切重链乳腺表达载体pBC1-HuG1F和轻链乳腺表达载体pBC1-HuK1F，回收含有嵌合抗体重链的基因片段和含有嵌合抗体轻链的基因片段，回收的基因片段分别溶于TE溶液，再将含有上述两种基因片段的溶液等摩尔比混合，混合溶液稀释至终浓度为1.0-2.5μg/ml，然后将所述的混合溶液注射到小鼠的受精卵原核中，再将受精卵移植到同期发情的假孕母鼠输卵管中，产生子代，鉴定，得到转基因小鼠，利用其乳腺来生产抗人CD20单克隆抗体；(4)用SalI分别酶切轻链乳腺表达载体pBC1-HuK1F、重链乳腺表达载体pBC1-HuG1F和双标记选择载体pCE-EGFP-IRES-NEO，分别回收含有嵌合抗体轻链的基因片段、含有嵌合抗体重链的基因片段及含有绿色荧光蛋白和新霉素抗性两个筛选标记的基因片段，回收的基因片段分别溶于TE溶液，再将回收的含有嵌合抗体轻链基因片段的溶液和含有嵌合抗体重链基因片段的溶液等摩尔比混合，然后将含有上述两种基因片段的溶液与回收的含有双标记基因片段的溶液按摩尔比3-10∶1混合，再将制得的混合溶液转入到大型家畜的胎儿成纤维细胞中，制得转基因供体细胞；再将所述供体细胞核移入去了核的卵母细胞内，融合，培养，制得转基因克隆囊胚，然后将所述的克隆囊胚移入已同期发情的受体大型家畜的子宫内，产生子代，鉴定，得到转基因大型家畜，利用其乳腺来生产抗人CD20单克隆抗体。