[发明专利]原核细胞非融合可溶性表达体系

摘要

本发明是一种原核细胞非融合可溶性表达体系，它是将一种特定辅助蛋白基因或二种特定辅助蛋白基因与预表达的外源目的基因共建在一个转录单位中，在同一个原核表达宿主细胞，通过特定辅助蛋白基因与预表达的外源目的基因各自独立翻译调控系统进行胞内共同表达，利用特定辅助蛋白实现外源目的基因的非融合可溶性表达，尤其是含有较多二硫键的肽链得以非融合可溶性表达。如80个左右氨基酸残基组成的含四对二硫键的肽链，通过本原核细胞非融合可溶性表达体系，在原核细胞的一般生理条件下，使其在大肠杆菌细胞内的表达量占菌体总蛋白的10％以上，90％以上的表达产物为可溶性。

主权项

1.原核细胞非融合可溶性表达体系，其特征在于：在一个原核细胞转录单位，转录单位的启动子与终止子是目前原核细胞转录调控系统，T7-乳糖双启动子和T7终止子；T7启动子和终止子；T3启动子和终止子；SP6启动子和终止子；乳糖启动子和终止子；这个转录单位的最上游是一个具有独立翻译调控特征的多克隆位点区域，这个多克隆位点区域用于重组欲表达的各种外源目的基因，其目的是使外源目的基因能够得以高效表达；独立翻译调控的特征是通过原核细胞的rbs，核糖体结合位点，或称S-D序列以及AUG启始密码子调控外源目的基因的翻译或特定辅助蛋白基因的翻译；在具有独立翻译调控特征的多克隆位点区域后面，是具有独立翻译调控特征的特定辅助蛋白基因区域，在此区域后面也可加上具有独立翻译调控特征的另一种特定辅助蛋白基因区域；上述原核细胞转录单位的构成顺序是，转录启动子-rbs-AUG翻译启始密码子-多克隆位点-rbs-AUG翻译启始密码子-特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-转录终止子，简称转录单位I，rbs与AUG距离为3～11bp；或是，转录启动子-rbs-AUG翻译启始密码子-多克隆位点-rbs-翻译AUG启始密码子-第一种特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-rbs-翻译AUG启始密码子-第二种特定辅助蛋白基因-翻译终止密码子-翻译终止密码子-转录终止子，简称转录单位II，rbs与AUG距离为3～11bp；特定辅助蛋白是指能促进外源目的基因表达产物实现非融合可溶性表达的一类蛋白，硫氧还蛋白还原酶TrxA，二硫键异构酶DsbA、DsbB、PDI，脯氨酸顺反异构酶PPI，分子伴侣GroES、GroEL、DnaK、DnaJ以及有关能促进翻译的蛋白正确折叠而使其处于可溶的一类蛋白相关蛋白；转录单位I或转录单位II重组至一般性原核细胞的克隆质粒，该质粒本身具备可遗传特征和抗生素抗性基因，卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素，利用原核宿主细胞的复制酶系进行自身复制，含有重组的转录单位I或转录单位II的质粒就是原核细胞非融合可溶性表达体系，利用原核宿主细胞的转录、翻译酶系以及转录调控系统针对转录单位的，实现转录单位I或转录单位II中各基因的表达。