[发明专利]蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a抗肿瘤侵袭转移作用及应用

摘要

本发明公开了一种蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a抗肿瘤侵袭转移作用及应用，属于医学生物领域。本发明根据GenBank中的BJ46a基因序列(AF294836)，设计与合成BJ46a全基因。克隆到杆状病毒表达载体，在Sf9昆虫细胞生产具有抑制基质金属蛋白酶活性的重组BJ46a蛋白，并通过体内外实验证明其具有抗黑色素瘤细胞B16侵袭转移功能。本发明应用基因转染技术，建立稳定转染的B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a细胞株，通过体内外实验，证明BJ46a在基因水平抑制B16细胞侵袭转移。本发明应用于预防与治疗肿瘤的侵袭转移，具有巨大应用前景。

主权项

1. 一种蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a抗肿瘤侵袭转移作用的制备方法，其特征是：1)BJ46a杆状病毒表达载体的构建根据GenBank中序列AF294836，设计与人工合成相对应的20条互补的寡核苷酸，以及10对PCR引物，通过缓慢退火PCR法使之拼接为BJ46a基因，经SacI及XhoI双酶切后定向克隆到载体pET-42a(+)，PCR扩增、酶切及测序分析；用定点突变法逐一改正错误位点，获得含正确目的基因的pET-42a(+)/BJ46a质粒；在合成BJ46a基因的基础上，将其插入到杆状病毒转座载体pFastBac HT C的MCS中，转化大肠杆菌DH5α-T1，以LB/AP平板筛选、PCR扩增和酶切鉴定获得阳性重组子，提取pFastBac HT C-BJ46a重组体进一步转化DH10Bac感受态细胞，48h后通过蓝白筛选，挑取单个白色菌落划线，所得菌落均为白斑，从而构建杆状病毒重组转座载体、重组穿梭载体；2)重组BJ46a蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达、纯化利用杆状病毒表达系统生产蛋白，以Cellfectin脂质体与重组子Bacmid-BJ46a混合，转染Sf9昆虫细胞，获P1病毒；P1病毒再感染昆虫细胞获得更高滴度的P2病毒，进而扩增P3病毒；将重组杆状病毒感染Sf9，Westernblot示重组BJ46a蛋白表达；用滴度5×107pfu/ml的重组病毒P3感染Sf9细胞，MOI值为10pfu/cell，在感染后96h收集细胞；使用ProBondTM纯化系统对融合蛋白进行纯化，SDS—PAGE电泳分离；3)重组BJ46a蛋白生物学活性基质金属蛋白酶Clostridiumcollagenase终浓度分别为0.05U/ml、0.2U/ml、0.4U/ml，绘制酶反应动力学曲线；使用EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit检测重组BJ46a蛋白抑制MMPs活性；以加入抑制剂BJ46a的浓度为横坐标，基质金属蛋白酶残余活性％为纵坐标，绘制重组蛋白BJ46a对MMPs的抑制活性曲线，表明：BJ46a对MMPs抑制活性的IC50值为0.12mg/ml。