[发明专利]一种细菌质粒DNA提取的方法

摘要

本发明涉及分子生物学，具体地说是一种细菌质粒DNA的提取方法。具体为将微生物菌体在液体培养基中，25－30℃振摇过夜培养；将培养过夜的菌液中加入缓冲溶液，离心收集和洗涤得裂解菌体；质粒DNA的分离纯化，所得到的质粒DNA可直接用于酶切、PCR等多种分子生物学实验。本发明操作简便、安全、质量高、同时适用于革兰氏染色阴性细菌、革兰氏染色阳性细菌质粒DNA的提取，因此具有广泛的适用性。

主权项

1. 一种细菌质粒DNA提取的方法，其特征在于：1)细菌的培养：将挑取的细菌单菌落在细菌常用液体培养基中，25-30℃振摇过夜培养；2)菌体的收集、裂解：当细菌为革兰氏染色阴性菌时，取1.5-2.0mL培养16-24小时的菌液，并在10000-12000rpm下离心30-60秒，收集菌体；用1-1.5mL STE溶液洗涤两次，10000rpm离心30秒；而后在细菌沉淀中加入100-300μL溶液I，再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分钟，得裂解菌液；当为革兰氏染色阳性菌分别培养时，取3.0-4.0mL培养10-16小时的菌液，并在8000-10000rpm下离心60-90秒，收集菌体；用2.0-3.0mL STE溶液洗涤两次，10000rpm离心30秒；而后在细菌沉淀中加入100-200μL溶液I和50-100μL溶菌酶，37℃水浴30-60分钟，然后再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分钟，得裂解菌液；3)质粒DNA的复性、与染色体DNA分离：在步骤2)中得到的裂解菌液内加入150-400μL溶液III，冰浴15-20分钟，4℃下以12000rpm离心10分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4℃下再以12000rpm离心5分钟，取其沉淀待用；4)质粒DNA的沉淀：将步骤3)中的沉淀用100-400μL无菌重蒸水溶解，并加入溶解沉淀的无菌水的1/2体积的7.5mol·L-1NH4Ac和5mol·L-1LiCl，冰浴3-5分钟，4℃下以12000rpm离心5分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置40分钟，沉淀即为质粒DNA；其中：溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl，pH8.0和10mmol/L EDTA，pH8.0；溶液II为0.2mol/L NaOH和1％SDS；溶液III为溶液中含钾的浓度为3-5mol/L的KAc，和5mol/L乙酸根，pH4.8；NH4Ac和LiCl之间的摩尔比例是1∶1。