[发明专利]一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法

摘要

本发明公开了一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，属胚胎生物技术领域。该方法使用高硼硅毛细玻璃管，具体操作步骤包括：(一)冷冻液体的配置；(二)冷冻；(三)解冻液体的配置；(四)解冻。本发明采用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法与现有技术相比，具有不需昂贵仪器，成本花费低；操作简单方便，可以在生产现场操作；冷冻保存效果好，解冻后成活率高的特点。

主权项

1、一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法，其特征在于该方法的具体操作步骤如下：(一)、冷冻液体的配置：基础液：在100份组织和细胞培养液(TCM-199液)中添加20份-30份胎牛血清(V/V)和0.5份-1.5份庆大霉素溶液(V/V)；玻璃化冷冻液I：在100份基础液中添加10份-15份乙二醇(V/V)和10份-15份二甲基亚砜(V/V)；玻璃化冷冻液II：在100份基础液中添加30份-35份乙二醇(V/V)和30份-35份二甲基亚砜(V/V)；(二)、冷冻：使用四孔板，在四孔板的前三个孔中分别放置0.8毫升基础液、玻璃化冷冻液I和玻璃化冷冻液II；将待冷冻的卵母细胞或胚胎先放在基础液中；用移液器将2-4枚胚胎或卵母细胞转入玻璃化冷冻液I中平衡1-2分钟；然后将胚胎或卵母细胞转移到玻璃化冷冻液II中；之后用枪头吸入这几枚胚胎或卵母细胞连同4-6微升的玻璃化冷冻液II转移到空白孔处；毛细玻璃管利用虹吸作用将含卵母细胞或胚胎的液滴吸入毛细玻璃管的一端，以上操作在20-25秒内完成，然后无需封口，投入液氮，即可快速冷冻；(三)、解冻液体的配置：解冻液I：在100份基础液中添加0.25-0.35份蔗糖溶液；解冻液II：在100份基础液中添加0.1-0.2份蔗糖溶液；(四)、解冻：在四孔板的前两个孔中分别放置0.8毫升解冻液I和0.8毫升解冻液II，后两个孔中分别放置0.8毫升的基础液；从液氮中取出毛细玻璃管，在空气中停留3-4秒；之后将毛细玻璃管有卵母细胞或胚胎的一端插入解冻液I中，用食指堵住另一端，利用手指的温度驱使卵母细胞或胚胎进入到解冻液I中，停留3-5分钟；然后用移液器将卵母细胞或胚胎转移到解冻液II中，停留3-5分钟；之后将卵母细胞或胚胎转移到基础液中，停留3-5分钟；最后将卵母细胞或胚胎转移到另一基础液中，进行质量评定；以上操作均在体视显微镜35℃-37℃的加热板上进行。