[发明专利]一种激光致DNA损伤的检测方法

摘要

本发明公开了一种激光致DNA损伤的检测方法，该方法主要利用激光照射细胞，应用改进的单细胞凝胶电泳法，直接在预制的普通载玻片上铺胶、电泳、染色，在正置或倒置荧光显微镜下观察结果。图像用CASP软件分析，确定DNA是否有损伤，并对损伤情况分级。该方法在分子水平上简便、快速的定量检测激光致DNA损伤，不需特殊仪器，在倒置荧光显微镜下也可进行结果观察，克服了原来必须用磨砂载玻片而不能在倒置荧光显微镜下观察的不足，而且实验所需细胞量少，对实验人员无毒害。

主权项

1.一种激光致DNA损伤的检测方法，包含如下步骤：(1)选择与纯化细胞选择动植物细胞，常规方法制备，用PBS悬浮细胞，得细胞悬液；离心纯化；(2)调整细胞浓度进行细胞计数，调最终细胞浓度至8×105～2×106个/ml，备用；(3)用激光处理细胞将步骤(2)所述细胞分为五组依次记为：C、L5、L10、L15、L20，C组为对照组，采用激光器，以100～800μJ/cm2的能量密度对L5组照射5个脉冲，对L10组照射10个脉冲，对L15组照射15个脉冲，对L20组照射20个脉冲，备用；(4)检测激光致DNA的损伤程度1)预制盖玻片：将盖玻片放入酒精中浸泡10min后，备用；2)预制载玻片：在普通载玻片上滴加60～120μl NMA即正常熔点琼脂糖凝胶，加盖预制的盖玻片，于4℃下放置5-10min，待NMA冷凝后取下盖玻片，放入37℃烘箱中3～10min，用砂纸垂直按压凝胶，至凝胶表面有砂粒孔止，再放入烘箱干燥30～90min，至少预制五张载玻片，备用；3)向步骤2)预制好的载玻片上各滴加80～120μl NMA，并加盖预制盖玻片，于4℃下放置5～10min，待NMA冷凝后取下盖玻片，备用；4)将20～30μl对照组C组细胞与60～90μl LMA即低熔点琼脂糖凝胶混匀；取80～120μl混合液铺于载玻片上并加盖盖玻片，于4℃下放置5～10min后取下盖玻片；然后在其上滴加80～120μl NMA并加盖盖玻片，于4℃下放置5～10min；L5～L20组各组依同样的方法铺胶；5)将步骤4)制备好的五组载玻片放入一平皿中，加入50～100ml裂解液，裂解液使用量不少于10～15ml/片，以覆盖过载玻片为准；裂解1.5～2h；6)取出裂解后的载玻片，放入电泳槽，向槽中缓缓注入碱性电泳缓冲液，静置20～40min后开始电泳，电流200～250mA，电压18～25V，电泳时间为20min；7)电泳结束后，将载玻片放入中和缓冲液中，中和两次，每次10～20min；然后，向每个载玻片上滴加20～30μl浓度为1～2mg/ml的EB并加盖盖玻片，染色10～20min；8)荧光显微镜下观察实验结果，激发光波长为540nm；阳性结果为黑色背景，红色带有拖尾的DNA彗星图像；阴性结果为黑色背景，红色圆点状DNA图像；(5)DNA损伤程度的分级用CASP软件分析阳性结果，根据拖尾中DNA的量占细胞总DNA的比例，以百分比计，DNA损伤＜5％为0级，即正常细胞；DNA损伤5％～20％为1级，即低度损伤；DNA损伤20％～40％为2级，即中度损伤；DNA损伤40％～90％为3级，即高度损伤；DNA损伤＞95％为4级，即重度损伤。