[发明专利]一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法

摘要

本发明公开一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，主要步骤包括：以冬枣休眠芽水培萌发的幼嫩枝条为材料，离体培养诱导茎尖丛生芽的再生，切取茎尖在延伸培养上生长，以茎尖为受体采用农杆菌介导法在抽真空施加负压下进行遗传转化，获得冬枣转基因植株。本发明方法中，浸染环境附以真空度为0.95×10⁵Pa－0.3×10⁵Pa的负压条件，有效提高了转化频率，成功建立起一个高效的基因型制约小的冬枣转基因技术体系，对具有重要经济价值的枣的遗传改良有重要应用价值。

主权项

1.一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，由以下步骤实现：1)茎尖培养及诱导丛生芽再生，2)丛生芽的延伸培养，3)以茎尖为受体在抽真空施加负压下进行遗传转化，4)小苗生根和移栽，5)转基因植株分子检测；其特征在于：步骤1)所述茎尖培养及诱导丛生芽再生是指冬枣休眠芽在25-27℃培养箱中水培萌发，萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精预杀菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，无菌水冲洗3-4次后，接种在附加0.5-2mg L-1赤霉素和0.1-1mg L-1 6-苄基嘌呤的MS诱导培养基上，在温度25-27℃、光照强度3000-4000 Lx、光照12h/天条件下培养，35天继代一次；步骤2)所述的丛生芽的延伸培养是指将步骤1)再生的小芽接种在添加有1-3mg L-1 赤霉素、0.1-0.5mg L-1 6-苄基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培养基上以步骤2)所述条件培养，之后切取冬枣茎尖，备用；步骤3)所述的以茎尖为受体在抽真空施加负压下进行遗传转化是指取2-8mm的冬枣茎尖为受体，用解剖针均匀划伤茎尖顶端分生组织，同时将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌制成OD600值为0.2-1.2的梯度菌液，然后将划伤茎尖分别浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其间浸染环境附以真空度为0.95×105Pa-0.3×105Pa的负压条件，以提高农杆菌的浸染效率；浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养2-8天；暗培养结束后，将茎尖用无菌水洗2-3次，然后转至含100mg L-1头孢霉素MS延伸培养基上，抑菌培养7-14天，之后在含0.5-3mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3-5代，每代7-10天；然后转入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-1 6-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养；步骤4)所述的小苗生根和移栽是指将步骤3)所述恢复培养后存活的茎尖继续培养，待长至株高为1.5-2cm后，转入Nitsh生根培养基中生根，根生长至1.5-3cm后，移入砂与蛭石体积比为1∶1的基质中继续生长；步骤5)转基因植株分子检测是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法对转基因植株检测，根据是否有目的基因条带，确定冬枣转基因植株。