[发明专利]一种快速克隆和鉴定细菌β-半乳糖苷酶基因的方法无效

专利信息
申请号: 200710014994.2 申请日: 2007-06-28
公开(公告)号: CN101086012A 公开(公告)日: 2007-12-12
发明(设计)人: 孔健;孔文涛;季明杰 申请(专利权)人: 山东大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/70;C12N1/21
代理公司: 济南金迪知识产权代理有限公司 代理人: 许德山
地址: 250100山东省济南市历*** 国省代码: 山东;37
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摘要: 发明公开了一种从细菌中快速克隆和鉴定β-半乳糖苷酶基因的方法。本发明在商品化载体pUC18和pUC19基础上,通过反向PCR技术删除了载体上携带的、位于载体334-489位、长度为156bp的核苷酸序列,从而获得本发明的载体pUC18(lac)和pUC19(lac)。利用本发明的载体pUC18(lac)和pUC19(lac)构建DNA文库,可根据在IPTG、X-gal的LB培养基平板上形成的蓝色/白色菌落,对含有β-半乳糖苷酶基因的重组子进行快速鉴定和克隆,并根据蓝色菌落形成是否需要IPTG诱导,对β-半乳糖苷酶基因的启动子类型进行鉴定。
搜索关键词: 一种 快速 克隆 鉴定 细菌 半乳糖 基因 方法
【主权项】:
1.一种快速克隆和鉴定细菌β-半乳糖苷酶基因的方法,由以下步骤组成:(1)Lac-载体的构建:选择市售能与宿主菌E.coli JM109或E.coli DH5α形成α互补的载体pUC18、pUC19之一,以其任何一种质粒DNA为模板,通过反向PCR进行扩增,扩增后的PCR产物经过切胶回收,再使用Xho I内切酶37℃处理,并对酶切片段纯化,然后加入T4DNA连接酶连接;取上述连接液与E.coli JM109或E.coli DH5α感受态细胞混合,冰浴,42℃热冲击90s,冰上放置2min后,加入LB培养基37℃培养2h,涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板,37℃培养过夜,挑取转化子,提取质粒DNA,即得到遗传改造后的载体pUC18(lac-)或pUC19(lac-);其中:上述反向PCR使用的引物序列为:引物pUCF:5’GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3’;引物pUCR:5’ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3’;PCR条件:94℃ 4min;94℃ 40s,58℃ 40s,72℃ 2min,共30个循环;72℃延伸10min;(2)DNA文库构建:以改良的CTAB提取法提取目的菌株的基因组DNA,根据(1)构建的载体pUC18(lac-)或pUC19(lac-)上含有的常用限制性内切酶酶切位点BamHI,HindIII,PstI,KpnI,EcoRI,XbaI,分别对提取得基因组DNA进行酶切,酶切时间控制在2-4h;选取能将DNA完全切成弥散条带的内切酶,按照上述条件再次酶切提取的基因组DNA,回收2-6Kb之间的DNA片段,并使回收后DNA浓度不小于10ng/μL;同时使用相同内切酶单酶切pUC18(lac-)或pUC19(lac-)质粒DNA,并去磷酸化处理,再利用Gel Extraction Kit回收目的DNA片段,并使回收后DNA浓度不小于10ng/μL;将载体DNA与外源DNA片段按体积比1∶3-10的比例混合,加入T4DNA连接酶连接,连接液42℃热击转化E.coli JM109或E.coliDH5α感受态细胞,加入LB液体培养基培养2h后,得到重组DNA文库;其中:上述改良的CTAB提取菌株基因组DNA的方法是:①取3mL过夜培养的菌液,离心收集菌体;②重悬于567μL含2mg/mL溶菌酶的TE缓冲液,37℃处理1h;③加入30μL 10%的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K,37℃继续作用1h;④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min;⑤等体积的氯仿异戊醇抽提后加入终浓度100μg/mL的RNaseA溶液,37℃处理30min;⑥用等体积的酚氯仿异戊醇和氯仿异戊醇各抽提一次,加入等体积异丙醇-20℃沉淀20min;⑦12000rpm离心10min,收集DNA,用70%乙醇洗涤2次,干燥后,溶于40μL重蒸无菌水中;步骤(1)和步骤(2)中所述E.coli感受态细胞的制备过程是:①从平板上挑取E.coliJM109或E.coliDH5α单菌落于5mL LB液体培养基中,37℃培养过夜;②以2%接种量转接5mL新鲜LB液体培养基,摇床培养2-3h至OD600=0.4-0.6;③冰浴10min,4℃5000rpm离心5min,收集菌体;④弃去上清,用750μL预冷的0.1M CaCl2重悬菌体,冰上放置10min;⑤4℃ 5000rpm离心5min,弃去上清,菌体用100μL预冷的0.1M CaCl2 悬浮,即得感受态细胞;(3)β-半乳糖苷酶基因重组子的筛选:将上述(2)构建的DNA文库稀释,取稀释液均匀涂布于含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和氨苄青霉素的LB培养基平板上,37℃培养24h-28h,挑取蓝色菌落,并进一步在相同的培养基平板上反复划线验证,菌落仍然显蓝色,则推断为该重组子含有β-半乳糖苷酶基因片段;其中:上述IPTG、X-gal和氨苄青霉素的LB培养基配方及制备方法是:蛋白胨1g,酵母粉0.5g,NaCl 0.5g,琼脂粉1.5g,100mL蒸馏水,pH7.2-7.4;121℃高压蒸汽灭菌20min;待冷却至60℃左右,加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/mL 5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷和100μg/mL氨苄青霉素,混匀后,倾注已灭菌的培养皿内,备用;(4)β-半乳糖苷酶基因启动子类型的鉴定:挑取上述(3)纯化的蓝色菌落,接种在含有X-gal和氨苄青霉素的LB培养基平板上,菌落仍能显示蓝色,则推断β-半乳糖苷酶基因的启动子为组成型;如在含有X-gal和氨苄青霉素的LB培养基平板上为白色,在含有IPTG、X-gal和氨苄青霉素的LB培养基平板上则显示蓝色的菌落,则推断β-半乳糖苷酶基因的启动子为诱导型。
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