[发明专利]基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法

摘要

基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，涉及生物技术，将免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法结合起来，即，利用酶联免疫吸附检测法中的96孔塑料板来捕获目的蛋白(蛋白质A)—兴趣蛋白(蛋白质B)-抗兴趣蛋白抗体复合物，然后用抗兴趣蛋白抗体相对应的辣根过氧化物酶标记二抗，显色，酶标仪检测。本发明简化了实验过程，提高了检测系统的敏感度，具有稳定性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率。

主权项

1.基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：按照下述步骤进行：(1)细胞内总蛋白的提取：用磷酸缓冲液洗涤细胞，然后，在细胞中加入细胞裂解液，将细胞离心，取上清液备用；(2)用蛋白质A的抗体包被96孔塑料板：选择与蛋白质A相应的抗体，抗体从商业公司订购，用碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释抗体，稀释浓度为1～10μg/ml，再将稀释液加入到96孔塑料板中进行包被，每孔加100～200μl，37℃2～6小时或4℃过夜；(3)封闭：用1～2wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭余下的空白位点，37℃中孵育4～6小时；(4)加样：将步骤1中的上清液稀释，总蛋白浓度为1～10μg/ml，再将稀释液加入到步骤2中已包被的塑料板的反应孔中，每孔加100～200μl，在37℃中孵育1～2小时，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；(5)加入与蛋白质B的一抗：选择与蛋白质B相应的抗体，抗体从商业公司订购，磷酸盐缓冲液稀释抗体，浓度为10～20μg/ml，于各反应孔中，加入稀释的蛋白质B的抗体100～150μl，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；(6)于各反应孔中，加入与蛋白质B的抗体相应的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；(7)加底物液显色：于各反应孔中加入显色底物溶液100～150μl，37℃放置10～30分钟；(8)终止反应：于各反应孔中加入0.1-0.2mmol硫酸；(9)结果判定：在酶标仪检测仪上，检测吸光度。