[发明专利]海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用

摘要

本发明公开了一种海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用方法。EhMT1的cDNA序列GenBank登录号为DQ059081及编码的氨基酸序列GenBank登录号为AAY57923。本发明为海州香薷中首次报道的金属硫蛋白基因及其应用。EhMT1参与了铜在海州香薷根系的积累，mRNA表达分析表明该基因在海州香薷受过量铜的诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了烟草的耐铜性及对铜的积累。EhMT1可作为目的基因导入植物，提高植物耐铜性及对铜的积累。

主权项

1、海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用，包括：1)总RNA的提取以海州香薷为实验材料，待海州香薷幼苗长至7-8叶期后，用50μM CuSO4进行处理，48小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存；取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5ml离心管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5ml离心管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2)海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的克隆设计两端引物引物P1：5′-ACGTCGATCACTAAGAAAAG-3′引物P2：5′-CTTAGACGCATAAACACGAA-3′以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸45min，28个循环后，72℃7min，将PCR产物进行克隆、测序后获得具有完整编码区的海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列；3)植物表达载体的构建根据海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列，见GenBank登录号为DQ059081的全长编码序列，设计编码完整阅读框的引物引物P3：5′-GTCTAGAAAGAAAATGTCGAGTGGA-3′引物P4：5′-CCCGGGAGGCAGTATATCTGACAG-3′并分别引入限制性内切酶位点，以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将EhMT1的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体PBI121；4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转化烟草，对获得的转基因植株进行PCR、RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T0代和野生型烟草进行50μM CuSO4的持续处理，观察他们的生长表现，在铜处理12天后的表现明显优于野生型的转基因烟草植株即为获得的耐铜转基因植株。