[发明专利]一种用于As污染土壤修复的微生物菌株的筛选方法

摘要

一种用于As污染农田土壤植物修复的微生物菌株的筛选方法。从As污染土壤中先筛选能耐As的菌株，通过逐级提取方法分析这些菌株是否能改变γ－射线灭菌的As污染土壤中的As形态、以及是否产生能促进植物生长的吲哚乙酸(IAA)，从而筛选出能够改变土壤中生物可利用态As含量的菌株，并通过盆栽试验验证通过此方法筛选菌株能利于植物生长和增加植物吸收的As量和效率。本发明的方法操作简便，操作环境友好，且用于植物修复时不会带来二次污染，处理成本降低，而植物修复As污染土壤的效率提高。

主权项

1.一种用于As污染土壤修复的微生物菌株的筛选方法，其特征在于筛选步骤为：a.将混匀的植物根际新鲜土直接接入灭菌的含As的细菌和真菌液体培养基中，其中，细菌液体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，用NaOH溶液将其pH值调节至7.0-7.2的范围，真菌液体培养基为马丁氏培养基，用NaOH溶液调节pH值至约6.5，两种液体培养基中添加有Na2HAsO4，使得两种培养基的As浓度为50-1000mg/kg，两种培养基在28℃、120r/min条件下摇床培养一周，每周转接一次，每次转接时以新鲜液体培养基体积的1～5％的接种量接入新鲜培养基中，如此重复三～五次；然后，用梯度稀释法分离菌株得到纯的细菌和真菌单菌落；b.将上步所得单菌落分别接种于不含Na2HAsO4的液体牛肉膏蛋白胨培养基和液体马丁氏培养基内培养，将两种培养液分别在4℃下离心后，倾去上清液，用无菌蒸馏水洗涤沉淀物，再用无菌水制成细菌和真菌的菌悬液；c.接种上述菌悬液于不含Na2HAsO4的牛肉膏蛋白胨培养基中，再加入γ-射线灭菌As污染土壤，培养结束后，把溶液倒入烧杯中，用水洗涤三角瓶中残留物于烧杯中，烘干至衡重，通过逐级提取法对残留物进行As形态的分析，从而筛选出能改变土壤中As形态的细菌和真菌菌株；d.将上步筛选出的细菌、真菌菌株分别接种于不含Na2HAsO4的牛肉膏蛋白胨液体培养基和马丁氏液体培养基内培养，将上述两种培养液分别离心，离心后所得沉淀物中直接加入3mL pH＝7.5含质量浓度1％的葡萄糖的磷酸盐缓冲液中，再加入2mL质量浓度1％的L-色氨酸后，在37℃下培养24h，培养结束后，加入2mL质量浓度5％三氯乙酸和1mL 0.5mol/LCaCl2，过滤，移出3mL滤液于测定管中，向管中加入2mL Salper溶液后在25℃的黑暗条件下培养30min，培养结束后在用722型分光光度计波长535nm下测定吲哚乙酸含量，标准曲线使用吲哚乙酸0-20mg/L的范围，测定菌株产IAA的能力，从而筛选出利于植物生长的细菌菌株、真菌菌株。